In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen zum Gemcitabinmetabolismus von Makrophagen im Duktalen Adenokarzinom des Pankreas

In vitro and in vivo studies on gemcitabine metabolism by macrophages in pancreatic ductal adenocarcinoma

by Sören Matthias Buchholz
Doctoral thesis
Date of Examination:2022-09-27
Date of issue:2022-09-26
Advisor:Dr. Albrecht Prof Neeße
Referee:Dr. Albrecht Prof Neeße
Referee:Prof. Dr. Michael Zeisberg
Referee:Prof. Dr. Matthias Dobbelstein
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9454

 

 

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Abstract

English

Despite great scientific and clinical efforts, pancreatic cancer still has a fatal prognosis. In addition to the usually late diagnosis, this is mainly due to the tumour's resistance to chemotherapy. Gemcitabine and nab-Paclitaxel, together with the FOLFIRINOX therapy regimen, are the most established protocols in the therapy of non-resectable pancreatic carcinoma. In recent years, the role of the tumour microenvironment in chemotherapy resistance has increasingly come to the fore. There are many indications that the tumour stroma not only forms a biophysical barrier, but primarily contributes to chemotherapy resistance through epigenetic and metabolic processes. Our research group has already shown that cancer-associated fibroblasts take up gemcitabine and thus reduce its availability to the tumour. Macrophages form the largest cell population in pancreatic adenocarcinoma; a gemcitabine-metabolising effect has not yet been investigated for them. In this study, the extent to which human and murine macrophages take up and metabolise gemcitabine was first investigated in vitro using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Subsequently, the effect of this metabolisation on human and murine pancreatic carcinoma cells was analysed by means of co-culture experiments. In addition, the effect of macrophage depletion by liposomal clodronate on gemcitabine therapy was investigated using the KC and KPC mouse model. Mass spectrometry showed that human and murine macrophages take up, partially inactivate and partially accumulate gemcitabine. This leads to an increased viability of tumour cells after incubation of gemcitabine on macrophages. A comparable effect cannot be shown for 5-FU and paclitaxel. A combination of gemcitabine with liposomal clodronate showed no significant clinical differences in the KPC mouse model compared to treatment with gemcitabine alone. Histologically, an increase in the proportion of Cleaved-Caspase-3-positive cells showed a significant increase in apoptosis rate, while cell proliferation measured by Ki-67 staining was unchanged. However, long-term treatment of KC mice with liposomal clodronate resulted in the formation of ascites. Our experiments showed that macrophages take up and metabolise gemcitabine and their depletion in vivo leads to a better response of gemcitabine. Other studies show other positive effects of depleting macrophages, such as less metastasis and an improved immune response to the tumour. Macrophages are part of the largest cell population in pancreatic cancer. Their depletion, combined with classical chemotherapy, is a promising approach that will be tested in clinical trials in the near future.
Keywords: pancreatic cancer; macrophage; chemoresistance; tumor microenvironment

German

Trotz großer wissenschaftlicher und klinischer Anstrengungen hat das Pan-kreaskarzinom weiterhin eine fatale Prognose. Dafür ist neben der meist erst spät gestellten Diagnose vor allem die Chemotherapieresistenz des Tumors verantwortlich. Gemcitabin und an Albumin gebundenes Paclitaxel sind mit dem FOLFIRINOX-Schema die etabliertesten Protokolle in der Therapie des nicht resektablen Pankreaskarzinoms. In den letzten Jahren rückte die Rolle des tumor microenvironment in der Che-motherapieresistenz immer stärker in den Vordergrund. Vieles deutet darauf hin, dass das Tumorstroma nicht nur eine biophysikalische Barriere bildet, sondern primär durch epigenetische und metabolische Prozesse zur Chemo-therapieresistenz beiträgt. Unsere Arbeitsgruppe hat bereits gezeigt, dass cancer associated fibroblasts Gemcitabin aufnehmen und so für den Tumor die Verfügbarkeit reduzieren. Makrophagen bilden die größte Zellpopulation im Pankreaskarzinom; für sie ist ein gemcitabinmetabolisierender Effekt bisher nicht untersucht. In dieser Arbeit wurde zunächst in vitro mit Liquid-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie untersucht, in welchem Maß humane und murine Makrophagen Gemcitabin aufnehmen und metabolisieren. Mittels Co-Kultur-Versuchen wurden anschließend die Auswirkung dieser Metabolisie-rung auf humane und murine Pankreaskarzinomzellen analysiert. Außerdem wurden die Auswirkung einer Makrophagendepletion durch liposomales Clodronat auf die Gemcitabintherapie in den murinen In-vivo-Pankreaskarzinommodellen KPC und KC untersucht. Massenspektrometrisch zeigte sich, dass humane und murine Makrophagen Gemcitabin aufnehmen, teilweise inaktivieren und teilweise speichern. Das führt zu einer erhöhten Viabilität von Tumorzellen, wenn das Gemcitabin vorher auf Makrophagen inkubiert wurde. Ein vergleichbarer Effekt kann für 5-FU und Paclitaxel nicht gezeigt werden. Eine Kombination von Gemcitabin mit liposomalem Clodronat zeigte im KPC-Mausmodell keine signifikanten klinischen Unterschiede im Vergleich zur Behandlung nur mit Gemcitabin. Histologisch zeigte sich bei Erhöhung des Anteils der cleaved-caspase-3-positiven Zellen eine signifikante Erhöhung der Apoptoserate, während die durch Ki-67-Färbung gemessene Zellprolifera-tion unverändert ist. Die Langzeitbehandlung von KC-Mäusen mit liposoma-lem Clodronat führte jedoch zur Bildung von Aszites. Unsere Versuche konnten zeigen, dass Makrophagen Gemcitabin aufnehmen und metabolisieren und ihre Depletion in vivo zu einem besseren Ansprechen von Gemcitabin führt. Andere Studien zeigen weitere positive Effekte einer Depletion von Makrophagen, etwa weniger Metastasierung und eine verbes-serte Immunantwort auf den Tumor. Makrophagen sind Teil der größten Zellpopulation im Pankreaskarzinom. Ihre Depletion, kombiniert mit klassi-scher Chemotherapie, ist ein vielversprechender Ansatz, der in naher Zukunft durch klinische Studien überprüft werden wird.
 
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