Funktionelle und mechanistische Charakterisierung von EZH2 in Atm-defizienten Subtypen des Pankreaskarzinoms

Goldfuß, Luise Annina

dc.contributor.advisor	Hessmann, Elisabeth Prof. Dr.
dc.contributor.author	Goldfuß, Luise Annina
dc.date.accessioned	2022-11-09T07:21:21Z
dc.date.available	2022-12-07T00:50:08Z
dc.date.issued	2022-11-09
dc.identifier.uri	http://resolver.sub.uni-goettingen.de/purl?ediss-11858/14327
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9547
dc.description.sponsorship	Deutsche Gesellschaft für Gastroenterologie, Verdauungs- und Stoffwechselkrankheiten (DGVS)	de
dc.language.iso	deu	de
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
dc.subject.ddc	610	de
dc.title	Funktionelle und mechanistische Charakterisierung von EZH2 in Atm-defizienten Subtypen des Pankreaskarzinoms	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.title.translated	Functional and mechanistic characterization of EZH2 in Atm-deficient PDAC subtypes	de
dc.contributor.referee	Hessmann, Elisabeth Prof. Dr.
dc.date.examination	2022-11-30	de
dc.description.abstractger	Das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) soll bis 2030 die zweithäufigste krebsassoziierte Todesursache nach dem Bronchialkarzinom darstellen. Eine wesentliche Ursache für die schlechte Prognose des PDACs ist die Resistenz gegenüber etablierten Chemotherapeutika. Das schlechte Therapieansprechen wird durch die intra- und intertumorale PDAC Heterogenität begünstigt. Aktuelle präklinische und klinische Ansätze fokussieren daher auf der Etablierung neuer individualisierter Therapieverfahren, die die molekularen Charakteristika des Tumors berücksichtigen. Eine molekulare Veränderung des PDACs mit therapie-prädiktiver Bedeutung ist der Verlust des Desoxyribonukleinsäure-Reparaturgens ataxia teleangiectatica mutated (ATM), welcher in ca. 12% aller PDACs festgestellt werden konnte. Im transgenen Mausmodell des PDACs führt der Verlust von Atm in Kombination mit konstitutiv aktivem kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS) zu einer schnelleren Tumorprogression und einer Verkürzung des Gesamtüberlebens. Zudem konnte in Untersuchungen muriner Atm-defizienter PDAC Subtypen eine Überexpression der Histonmethyltransferase enahncer of zeste homolog 2 (EZH2) gezeigt werden, welche im PDAC mit einer hohen Therapieresistenz, fortgeschrittenen Tumorstadien und einer schlechten Prognose assoziiert ist. Die Ziele dieser Arbeit fokussierten sich auf die funktionelle und mechanistische Charakterisierung von EZH2 in Atm-defizienten PDAC-Subtypen. Anhand von genetischer (siRNA) und pharmakologischer (EPZ-6438) Inhibition von EZH2 in murinen PDAC-Zelllen mit konditionaler Expression (p48Cre) von konstitutiv aktivem KRAS und homozygoter Atm-Defizienz (KATMC-Zelllinien) wurden die onkogenen Funktionen von EZH2 untersucht. Annexin- und Propodiumiodid-Färbung mit anschließender Analyse im Durchflusszytometer erfolgten zur Untersuchung der Apoptoserate nach EZH2-Inhibition. Untersuchungen der Zellviabilität erfolgten anhand von MTT-Tests. Es erfolgte die Zucht und Charakterisierung von transgenen Mäusen mit konditionaler Expression (p48Cre) von konstitutiv aktivem KRAS und homozygoter Atm-Defizienz (KATMC), welche mit transgenen Mäusen mit zusätzlicher Ezh2-Defizienz (KATMEC) verglichen wurden. Beide Mauslinien wurden in Bezug auf phänotypische Unterschiede, das Gesamt- und tumorassoziierte Überleben, die Tumorinzidenz und die Metastasierungsrate miteinander verglichen. Histologische Analysen erfolgten zur Untersuchung des Einflusses von EZH2 auf die Karzinogenese und die Tumorprogression. Außerdem wurden drei primäre Tumorzelllinien von tumortragenden KATMEC Mäusen isoliert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der EZH2-Verlust im transgenen Mausmodell spezifisch im Kontext der Atm-Defizienz zu einem signifikant verlängerten Gesamt- und tumorassoziierten Überleben führt. Trotz gleicher Gewichtsentwicklung während der ersten zwölf Wochen waren KATMC Mäuse zum Todeszeitpunkt signifikant leichter als KATMEC Mäuse. In KATMEC Mäusen zeigte sich außerdem eine stärkere Proliferationsrate sowie E-Cadherin Expression während der Karzinogenese im Gegensatz zu KATMC Mäusen. Zudem konnte eine stärkere E-Cadherin Expression auch in KATMEC Tumoren gezeigt werden. In vitro konnte eine verstärkte Apoptoseinduktion nach Ezh2-Knockdown im Kontext der Atm-Defizienz festgestellt werden. Nach Hemmung der Methyltransferaseaktivität von EZH2 durch EPZ-6438 war eine verstärkte Apoptoseinduktion jedoch nicht feststellbar. Es wurden drei primäre KATMEC Pankreastumorzelllinien etabliert. Unterschiede zwischen KATMC und KATMEC Tumorzelllinien im Hinblick auf die Apoptoserate und Zellviabilität konnten jedoch nicht gezeigt werden. Die im Rahmen dieser Doktorarbeit erhobenen Daten unterstützen die Hypothese, dass EZH2 in Atm-defizienten PDAC Subtypen zur Tumorprogression beiträgt. Die EZH2 Inhibition könnte somit eine vielversprechende therapeutische Option in Atm-defizienten PDAC Subtypen darstellen. Weiterhin sprechen die Daten dieser Arbeit für die Relevanz der molekularen Stratifizierung des ATM-Status vor Einleitung einer Therapie mit EZH2-Inhibitoren im PDAC.	de
dc.description.abstracteng	Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is predicted to be the second cancer associated cause of death after lung cancer by 2030. The dismal prognosis of PDAC is mainly driven by its resistance towards common cancer therapies which is predominantly caused by the intra- and interindividual molecular PDAC heterogeneity. Consequently, novel, stratification-based therapeutic strategies are urgently required to improve therapeutic responses and PDAC prognosis. One genetic alteration with therapy-predictive implications is the loss of the deoxyribonucleic acid damage gene ataxia teleangiectatica mutated (ATM) which occurs in around 12% of all PDAC specimen. In a transgenic mouse model, Atm loss in combination with oncogenic kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS) activation promoted tumor progression and shortened survival. Moreover, preliminary data links ATM-deficient PDAC subtypes with over-expression of the tumor promoting histone-methyltransferase enhancer of zeste homolog 2 (EZH2). The aim was to characterize the functional implications of EZH2 expression in ATM-deficient PDAC subtypes. In order to examine oncogenic EZH2-functions, genetic (siRNA) and pharmacological (EPZ-6438) approaches were used to interfere with EZH2 activity in murine PDAC cells with constitutively active KRAS and an ATM deficiency (KATMC cell lines). Annexin V-propodium iodide stainings and flow cytometry were used to compare apoptosis of Atm-deficient PDAC cells in the presence and absence of EZH2. Furthermore, MTT Assays were used to analyze cell viability. Moreover, a transgenic mouse model with conditional activation of KRAS and Atm- and Ezh2-deficiency was generated (KATMEC mice). Mice were evaluated for phenotypic differences, survival, tumor-incidence and metastasis in comparison to EZH2 expressing control littermates (KATMC mice). Histological analysis was utilized to characterize the impact of EZH2 expression on the formation of PDAC precursor lesions and PDAC development. Tumor baring KATMEC animals were further subjected to primary PDAC cell isolation. Characterization of the model showed that KATMEC mice have a significantly longer overall and tumor survival than KATMC control animals expressing EZH2. Despite similar growth during the first twelve weeks, KATMC mice showed a significantly reduced weight compared to KATMEC mice at time of death. During carcinogenesis higher proliferation rate and higher E-cadherin expression could be observed in KATMEC mice compared to KATMC mice. Furthermore, E-cadherin expression was higher in KATMEC pancreatic tumors. In vitro data showed increased apoptosis rates after Ezh2-knockdown in the context of Atm-deficiency. Nevertheless, after inhibiting EZH2 enzymatic activity by EPZ-6438 in the context of Atm-deficiency no induction of apoptosis was detectable. In addition, three stable tumor cell lines could be isolated out of the KATMEC transgenic mouse model to compare with KATMC cell lines in terms of functional parameters. When comparing primary isolated KATMC and KATMEC cell lines no differences in cell viability and apoptosis rate were perceived. Overall, our findings support the hypothesis of tumor progression-promoting EZH2 functions in ATM-deficient PDAC. Therefore, the inhibition of EZH2 might represent a promising therapeutic option in ATM-deficient PDAC subtypes. Together, these data argue for the relevance of molecular stratification regarding the ATM status prior to pharmacologically interfering with EZH2 activity and expression in PDAC therapy.	de
dc.contributor.coReferee	Ströbel, Philipp Prof. Dr.
dc.contributor.thirdReferee	Schön, Margarete Prof. Dr.
dc.subject.ger	ATM	de
dc.subject.ger	EZH2	de
dc.subject.ger	Pankreaskarzinom	de
dc.subject.ger	Epigenetik	de
dc.subject.eng	ATM	de
dc.subject.eng	EZH2	de
dc.subject.eng	epigenetics	de
dc.subject.eng	pancreatic cancer	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-ediss-14327-3
dc.affiliation.institute	Medizinische Fakultät	de
dc.subject.gokfull	Medizin (PPN619874732)	de
dc.subject.gokfull	Gastroenterologie (PPN61987578X)	de
dc.subject.gokfull	Onkologie (PPN619875895)	de
dc.description.embargoed	2022-12-07	de
dc.identifier.ppn	182139948X
dc.notes.confirmationsent	Confirmation sent 2022-11-09T07:45:02	de

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Human- und Zahnmedizin [2875]

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