Proliferation und Differenzierung von mesenchymalen Stromazellen auf biofunktionalisierten Copolymer-Trägern
Proliferation and differentiation of mesenchymal stromal cells on biofunctionalized copolymer scaffolds
by Michel Krier
Date of Examination:2023-02-23
Date of issue:2023-01-31
Advisor:PD Dr. Dr. Björn Florian Böhrnsen
Referee:PD Dr. Dr. Björn Florian Böhrnsen
Referee:Prof. Dr. Arndt Schilling
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9686
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Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract
English
AIM OF THE STUDY: To gain additional knowledge in the basic research of bone-tissue-regeneration, the task of the present work, as a proof of principle, was to find out the influence of different pore sizes of a special copolymer carrier on human stromal cells (hMSC), compared to those of a standard polymer. On the other hand, the influence of a biomimetic functionalization of this copolymer, using EZM-analogous polyelectrolyte multilayers (PEM), on the hMSC should be investigated. In addition, the influence of separate modifications of this EZM-analog PEM, through localized stiffness modifications and implementing a growth factor, on the hMSC should be investigated. MATERIALS AND METHODS: Two-photon polymerization (2PP) was used to fabricate 3D scaffolds with varying square open-box architecture from a synthetic, biocompatible (D,L) lactide-co-ɛ-caprolactone dimethacrylate copolymer (LCM3). The pore size ranged from 43 to 177 μm edge length. To determine the optimal cellular conditions of this degradable matrix, in vitro analysis of proliferation and differentiation of hMSC on LCM3 and comparison with a standard inorganic urethane dimethacrylate (UDMA) matrix was performed. To establish a biomimetic matrix surface structure, the synthetic co-polymers were modified by PEM consisting of a complex of the polypeptides poly-L-lysine (PLL) and chondroitin sulfate (CS). Poly-L-glutamic acid (PGA) was used to modify the stiffness of the PEM. To further functionalize the PEM, a growth factor was also incorporated using recombinant bone morphogenetic protein 2 (rhBMP 2). Counting and statistical analysis of hMSC labeled by immunofluorescence and immunohistochemistry was performed after one to five and seven to 21 days, respectively. RESULTS: Significant proliferation of hMSC was evident for pore sizes ranging from 56 to 123 μm (56 µm: p = 0.0008; 66 µm: p ≤ 0.0001; 78 µm: p = 0.0496; 96 µm: p = 0.0004; 123 µm: p = 0.0010). Continuous expression of vimentin as a classical marker of mesenchymal phenotype was observed for all pore sizes. PEM coating resulted in a significant increase in hMSC differentiation (p ≤ 0.01). This is characterized by osteonectin expression as an expression of the induction of bone mineralization. In the presence of PGA, proliferation on the PEM surfaces of LCM3 was significantly enhanced (p ≤ 0.0001). Osteonectin expression of hMSC remained the same after PGA-mediated structural rearrangement of PEM surfaces, but significantly increased compared to uncoated LCM3 (p = 0.0005). BMP-2 functionalization significantly enhanced hMSC proliferation and differentiation on PEM surfaces. At concentrations of 0.01 mg/ml (p ≤ 0.01), 0.05 mg/ml (p ≤ 0.001), and 0.10 mg/ml (p ≤ 0.0001), the proliferation of hMSC on rhBMP-2 modified LCM3 and protein expression of osteonectin increased significantly (p ≤ 0.05). DISCUSSION: The surface modification induced by microstructuring shows that the pores must be large enough to allow cell migration on the one hand, but must also remain small enough to provide sufficient cell adhesion. Proliferation of hMSC shows a dependence on material and pore size with better proliferation and integration on LCM3. Biofunctionalization by CS-PEM coating tends to be a more hydrogel-like, low Young's modulus type, which exhibits a random-coil conformation. Through modification, by means of an addition of PGA, the PEMs adopt an intermolecular ß-sheet structure, which leads to an increased elastic modulus of the surfaces. This leads to an improvement in proliferation and highlights the influence of surface stiffness in terms of cell-biomaterial interactions. Biofunctionalization by combining growth factor BMP-2 with PEM coating shows that improved proliferation and osteogenic differentiation can be demonstrated on LCM copolymer compared to UDMA even at low doses. CONCLUSION: The present study demonstrated that 3D supports prepared by 2PP from methacrylated (D,L)-lactide-co-ɛ-caprolactone copolymers with a pore size between 56 and 123 μm provide favorable conditions for hMSC proliferation. Surface modifications of the PEM films with PGA or by integrating growth factors, such as BMP-2, can positively influence the proliferation and differentiation of hMSC.
Keywords: Mesenchymal stromal cells; MSC; differentiation; proliferation; bone marrow mesenchymal stromal cells; BMSC; bone tissue regeneration; two-photon polymerization; 2PP; stiffness; bone morphogenetic protein 2; BMP2; BMP-2; copolymer; bone; multilayer; matrix; D,L-lactide-co-ε-caprolactone; porous architecture; urethane-dimethacrylate; UDMA; layer-by-layer; osteogenic; Vimentin; Osteonectin; osteokonduktiv
German
ZIEL DER STUDIE: Für einen zusätzlichen Wissensgewinn in der Grundlagenforschung der bone-tissue-regeneration, war die Aufgabe der vorliegenden Arbeit, als proof of principle, zum einen herauszufinden welchen Einfluss unterschiedliche Porengrößen eines speziellen Copolymer-Trägers auf humane Stromazellen (hMSC) haben, im Vergleich zu deren eines Standardpolymers. Zum anderen sollte der Einfluss einer biomimetischen Funktionalisierung dieses Copolymers, mittels EZM-analoger Polyelektrolyt-Multilayer (PEM), auf die hMSC untersucht werden. Außerdem sollte der Einfluss separater Modifikationen dieser EZM-analogen PEM, durch lokalisierte Steifigkeitsmodifikationen und dem Implementieren eines Wachstumsfaktors, auf die hMSC untersucht werden. MATERIAL UND METHODE: Mit Hilfe der Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP) wurden aus einem synthetischen, biokompatiblen (D,L) Lactid-co-ɛ-Caprolacton-dimethacrylat-Copolymer (LCM3) 3D-Gerüste mit unterschiedlich großer quadratischer Open-Box-Architektur hergestellt. Die Porengröße lag zwischen 43 und 177 μm Kantenlänge. Um die optimalen zellulären Bedingungen dieser abbaubaren Matrix zu bestimmen, erfolgte die in vitro Analyse der Proliferation und Differenzierung von hMSC auf LCM3 und der Vergleich mit einer Standard-Matrix aus anorganischem Urethan-dimethacrylat (UDMA). Zur Etablierung einer biomimetischen Matrixoberflächenstruktur wurden die synthetischen Co-polymere durch PEM, bestehend aus einem Komplex aus den Polypeptiden Poly-L-Lysin (PLL) und Chondroitinsulfat (CS), modifiziert. Mit Hilfe von Poly-L-Glutaminsäure (PGA) erfolgte die Modifizierung der PEM in ihrer Steifigkeit. Zur weiteren Funktionalisierung der PEM wurde unter Verwendung von rekombinantem bone-morphogenetic-protein 2 (rhBMP 2) zusätzlich ein Wachstumsfaktor eingebaut. Die Auszählung und statistische Auswertung der mittels Immunfluoreszenz und Immunhistochemie markierten hMSC erfolgte nach einem bis fünf bzw. sieben bis 21 Tagen. ERGEBNISSE: Eine signifikante Proliferation der hMSC zeigte sich für Porengrößen von 56 bis 123 μm (56 µm: p = 0,0008; 66 µm: p ≤ 0,0001; 78 µm: p = 0,0496; 96 µm: p = 0,0004; 123 µm: p = 0,0010). Eine kontinuierliche Expression von Vimentin als klassischer Marker für den mesenchymalen Phänotyp konnte für alle Porengrößen beobachtet werden. Durch die PEM-Beschichtung konnte eine signifikante Zunahme der hMSC-Differenzierung erzielt werden (p ≤ 0,01). Gekennzeichnet wird dies durch die Osteonectin-Expression als Ausdruck für die Induktion der Knochenmineralisation. In Gegenwart von PGA konnte die Proliferation auf den PEM-Oberflächen des LCM3 signifikant verbessert werden (p ≤ 0,0001). Die Osteonectin-Expression der hMSC blieb nach PGA-vermittelter Strukturumlagerung der PEM-Oberflächen gleich, im Vergleich zum unbeschichteten LCM3 jedoch signifikant erhöht (p = 0,0005). Durch die BMP-2-Funktionalisierung konnte die hMSC-Proliferation und -differenzierung auf PEM-Oberflächen signifikant verbessert werden. Bei Konzentrationen von 0,01 mg/ml (p ≤ 0,01), 0,05 mg/ml (p ≤ 0,001) und 0,10 mg/ml (p ≤ 0,0001) erhöhte sich die Proliferation von hMSC auf rhBMP-2 modifiziertem LCM3 sowie die Proteinexpression von Osteonectin signifikant (p ≤ 0,05). DISKUSSION: Die durch Mikrostrukturierung hervorgerufene Oberflächenmodifizierung zeigt, dass die Poren einerseits groß genug dimensioniert sein müssen, um die Zellmigration zu ermöglichen, aber ebenfalls klein genug bleiben müssen um eine ausreichende Zelladhäsion bereitzustellen. Die Proliferation der hMSC zeigt eine Abhängigkeit vom Material und der Porengröße mit einer besseren Proliferation und Integration auf LCM3. Die Biofunktionalisierung durch die CS-PEM-Beschichtung neigt zu einem eher hydrogelartigen, mit einem niedrigen E-Modul versehenen Typus, welcher eine random-coil-Konformation aufweist. Durch eine Modifikation, mittels einer Versetzung mit PGA, übernehmen die PEM eine intermolekulare ß-Faltblatt-Struktur, die zu einem erhöhten Elastizitätsmodul der Oberflächen führt. Dies führt zu einer Verbesserung der Proliferation und unterstreicht den Einfluss der Oberflächensteifigkeit in Bezug auf die Wechselwirkungen zwischen den Zellen und dem Biomaterial. Eine Biofunktionalisierung durch die Kombination des Wachstumsfaktors BMP-2 mit der PEM-Beschichtung zeigt, dass auf einem LCM-Copolymer im Vergleich zum UDMA bereits bei niedrigen Dosen eine verbesserte Proliferation und osteogene Differenzierung nachgewiesen werden kann. SCHLUSSFOLGERUNG: Die vorliegende Studie konnte zeigen, dass mittels 2PP hergestellte 3D-Träger aus methacrylierten (D,L)-Lactid-co-ɛ-Caprolacton-Copolymeren mit einer Porengröße zwischen 56 und 123 μm günstige Voraussetzungen für die hMSC-Proliferation liefern. Oberflächenmodifikationen der PEM-Filme mit PGA oder durch die Integration von Wachstumsfaktoren, wie BMP-2, können die Proliferation und Differenzierung von hMSC positiv beeinflussen.
Schlagwörter: mesenchymale Stromazellen; MSC; Differenzierung; Proliferation; Knochenmarkzellen; BMSC; Knochengeweberegeneration; Zwei-Photonen Polymerisation; 2PP; Steifigkeit; E-Modul; Steifigkeitsveränderung; bone morphogenetic protein 2; BMP2; BMP-2; Copolymer; Knochen; Multilayer; Matrix; D,L-Lactid-co-ε-Caprolacton; poröse Architektur; Urethan-dimethacrylat; UDMA; layer-by-layer; osteogen; Vimentin; Osteonectin