Kalziumhandling und Kalziumpufferung bei familiärer dilatativer Kardiomyopathie am Modell der induzierten pluripotenten Stammzellen

Calcium handling and calcium buffering in familial dilated cardiomyopathy in the induced pluripotent stem cell model

by Philipp Jung
Doctoral thesis
Date of Examination:2024-02-06
Date of issue:2024-01-29
Advisor:Prof. Dr. Niels Voigt
Referee:Prof. Dr. Niels Voigt
Referee:Prof. Dr. Katrin Streckfuß-Bömeke
Referee:Prof. Dr. Ralf Dressel
Sponsor:Promotionskolleg für Medizinstudierende (Jacob-Henle-Programm) der Universitätsmedizin Göttingen
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10281

 

 

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Abstract

English

Dilated cardiomyopathy (DCM) is a heterogeneous disease characterised by left ventricular dilatation and a reduced ejection fraction. In addition to progressive left heart failure, the poor clinical prognosis is primarily due to the increased incidence of ventricular tachycardia, which is associated with a high risk of sudden cardiac death. Genetic mutations play a significant role in familial DCM. Mutations in at least 30 genes are associated with a familial clustering of DCM. It is interesting to note that patients with gene mutations in sarcomeric proteins are particularly frequently affected by cardiac arrhythmias. While previous work has focussed primarily on the molecular mechanisms of impaired contractile function, little is known about the underlying pathomechanism of cardiac arrhythmias in patients with DCM. To investigate this in more detail, cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-CM) from DCM patients with an R173W point mutation (arginine to tryptophan) of cardiac troponin T (cTnT) were used in the present study. This mutation is known to be associated with a high incidence of ventricular arrhythmias. Using field stimulation experiments to measure cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i), TnT-R173W iPSC-CM were shown to have a lower threshold for [Ca2+]i-alternans compared to healthy control iPSC-CM of the same family. [Ca2+]i-alternans are known to be an indication of a proarrhythmogenic substrate of these cells. Patch-clamp studies were also performed to simultaneously measure Ca2+ currents and intracellular Ca2+ concentration. With the help of a caffeine protocol, the intracellular Ca2+ buffering could be further derived. This work shows for the first time an increased Ca2+ affinity of the intracellular buffers in TnT-R173W-CM, indicating an increased sensitivity of the myofilaments to Ca2+. Similarly, the use of EMD57033, a myofilament Ca2+ sensitiser, replicated the abnormal [Ca2+]i dynamics observed in TnT-R173W samples. EMD57033 also lowered the alternans threshold in field stimulation experiments. In contrast, application of a Ca2+ desensitizer (blebbistatin) to TnT-R173W iPSC-CM phenotypically rescued Ca2+ dynamics and minimised the occurrence of Ca2+ alternans at physiological frequencies. This finding suggests that increased Ca2+ buffering likely plays an important proarrhythmogenic role in DCM, particularly in patients with mutations in cardiac troponin T. Furthermore, this work provides evidence that modulation of myofilament Ca2+ sensitivity may be an effective antiarrhythmic target for pharmacological treatment of this disease.
Keywords: Calcium handling; Calcium buffering; Dilated cardiomyopathy; Troponin T; Arrhythmia; Patch clamp; iPSC-CM

German

Die Dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist ein heterogenes Krankheitsbild, welches durch eine linksventrikuläre Dilatation und eine verminderte Ejektionsfraktion definiert ist. Die schlechte klinische Prognose ist neben der progredienten Linksherzinsuffizienz vor allem auf die erhöhte Inzidenz von ventrikulären Tachykardien zurückzuführen, die mit einem hohen Risiko für einen plötzlichen Herztod einhergehen. Genetische Mutationen spielen bei der familiären DCM eine wesentliche Rolle. So sind Mutationen in mindestens 30 Genen mit einer familiären Häufung der DCM assoziiert. Es ist interessant, dass dabei insbesondere Patienten mit Genmutationen sarkomerischer Proteine besonders häufig von Herzrhythmusstörungen betroffen sind. Während sich bisherige Arbeiten vorrangig auf die molekularen Mechanismen der gestörten kontraktilen Funktion konzentrierten, ist über den zugrundeliegenden Pathomechanismus von Herzrhythmusstörungen bei Patienten mit DCM noch wenig bekannt. Um diesen näher zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit Kardiomyozyten, abgeleitet aus induzierten pluripotenten Stammzellen (induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, iPSC-CM) von DCM-Patienten mit einer R173W-Punktmutation (Arginin zu Tryptophan) des kardialen Troponin T (cTnT) verwendet. Von dieser Mutation ist bekannt, dass sie mit einer hohen Inzidenz von ventrikulären Rhythmusstörungen einhergeht. Mithilfe von Feldstimulationsversuchen zur Messung der zytosolischen Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) konnte gezeigt werden, dass TnT-R173W iPSC-CM im Vergleich zu gesunden Kontroll-iPSC-CM der gleichen Familie einen niedrigeren Schwellenwert für [Ca2+]i-Alternans aufweisen. [Ca2+]i-Alternans sind bekannterweise ein Hinweis auf ein proarrhythmogenes Substrat dieser Zellen. Weiter wurden Patch-Clamp Untersuchungen zur simultanen Messung von Ca2+-Strömen und der intrazellulären Ca2+-Konzentration durchgeführt. Mithilfe eines Koffeinprotokolls konnte weiterführend die intrazelluläre Ca2+-Pufferung abgeleitet werden. Diese Arbeit zeigt erstmalig eine erhöhte Ca2+-Affinität der intrazellulären Puffer in TnT-R173W-CM, was auf eine erhöhte Empfindlichkeit der Myofilamente gegenüber Ca2+ hinweist. In ähnlicher Weise konnte durch den Einsatz von EMD57033, ein Ca2+-Sensitizer für Myofilamente, die abnormale [Ca2+]i-Dynamik, die in TnT-R173W-Proben beobachtet wurde, repliziert werden. EMD57033 senkte zudem die Alternansschwelle in Feldstimulationsversuchen. Im Gegensatz dazu konnte die Anwendung eines Ca2+-Desensitizers (Blebbistatin) auf TnT-R173W iPSC-CM die Ca2+-Dynamik phänotypisch retten und das Auftreten von Ca2+-Alternans bei physiologischen Frequenzen minimieren. Dieser Befund deutet darauf hin, dass eine erhöhte Ca2+-Pufferung wahrscheinlich eine wichtige proarrhythmogene Rolle bei DCM, insbesondere bei Patienten mit Mutationen im kardialen Troponin T spielt. Darüber hinaus ergeben sich aus dieser Arbeit Hinweise, dass die Modulation der Ca2+-Sensitivität des Myofilaments ein wirksames antiarrhythmisches Ziel für die pharmakologische Behandlung dieser Krankheit sein könnte.
 
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