Extending the classical histological routine through microcomputed tomography imaging and multimodal image processing
Kumulative Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2024-03-06
Erschienen:2024-04-08
Betreuer:Prof. Dr Arndt F. Schilling
Gutachter:Prof. Dr Arndt F. Schilling
Gutachter:Prof. Dr. Frauke Alves
Gutachter:Prof. Dr. Timo Betz
Förderer:I was funded by the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) [grant number CT_LASER_BONE 13FH215PX8].
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Description:Full dissertation containing all articles
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Zusammenfassung
Englisch
Histological analysis has proven to be the de facto gold standard for the characterization of hard and soft tissue samples at cellular resolution in both clinical routine and biomedical research. After the tissue sample is obtained from e.g., a biopsy, it is fixed, chemically dried, and embedded in an infiltrating matrix, such as resin or paraffin. Thin sections are cut from the generated blocks, containing both tissue and matrix. These cut samples are then stained following established histological protocols targeting specific cell populations and components of the extracellular matrix. In most cases, this process requires the removal of the matrix material. Then the resulting slide undergoes microscopic imaging, generating the foundational data for subsequent analysis employing advanced digital image processing methodologies. Although this histological method can provide significant insights, it suffers from several drawbacks: i) the specimen is irreversibly altered during the procedure, ii) the data remains inherently two-dimensional (2D), iii) only a restricted portion of the specimen is usually examined due to the labor-intensive preparation steps, iv) the sectioning process lacks precise targeting of specific regions of interest (ROI), and v) the cutting procedure may induce distortions in the tissue. To capture and analyze the three-dimensional (3D) morphology of the specimen, prior to sectioning, it was scanned using micro-computed tomography (microCT), as proposed in current research. This allowed the fusion of specific local features visible under the microscope with the holistic 3D in silico representation of the specimen. An integral part of this multimodal fusion process is the precise matching of the 2D section into the 3D context of the tissue sample by image registration. Based on the specific characteristics present in both images, such as the local pixel intensity values, a geometric transformation is computed for varying degrees of freedom to ensure a precise overlay. Depending on whether the tissue is processed using a pathological saw or a microtome, there may be increasingly complex deformations present in the resulting section, necessitating the use of more sophisticated registration algorithms. This thesis focuses on the improvement of the established workflows in clinical practice and research to i) enrich the histological analysis through multimodal image fusion and subsequent analysis of higher-dimensional features and to ii) optimize the sectioning of hard and soft tissue samples ensuring successful co-registration of microCT and histological imaging. Through the application of multimodal fusion of microCT and histological images, methods for hard and soft tissue sectioning and analysis were optimized to enrich the information gained in the process. By adding 3D printed markers embedded in resin alongside hard tissue specimens, an independent solution to correlate identical slices in both microCT and histological images was implemented. This workflow not only integrated a quality control mechanism into the hard tissue histology routine, but also allowed the localization of 2D structures in the 3D context and laid the groundwork for correlating X-ray contrast and color information. Moreover, I was part of generating a multimodal workflow by correlating synchrotron propagation-based phase contrast micro-computed tomography scans (SRμCT) with stained histological slides for paraffin-embedded colorectal cancer specimens. We circumvented the problem of poor X-ray contrast produced by soft tissue in classical microCT imaging with the use of SRµCT, which allows for high-resolution scans (2 µm pixel size) with sufficient contrast. Due to the complex deformations present in the resulting sections obtained using a microtome, elastic registration was implemented to additionally compensate for stretching. In this thesis, I demonstrated the ability to transfer color-coded information from the 2D sections into the 3D scan and to segment higher-level features. Furthermore, the native microCT-coordinate system was employed to i) plan the sectioning for resin-embedded hard tissue specimens and to ii) automate the sectioning procedure through the development and implementation of a proprietary positioning system. This facilitated an enhancement of the traditionally manual procedure and enabled the generation of multimodal data sets. In conclusion, the work presented in this thesis contributes to established histological routines and information retrieval pipelines by expanding the histological image analysis into a 3D context. Furthermore, with the introduction of 3D printed markers for independent multimodal correlation and the streamlining of hard tissue specimen sectioning through automation, I created a solution that could contribute to established histological sectioning routines in terms of throughput and efficacy. These advancements promise to enhance clinical and research applications and have the potential to significantly contribute to approaches in the field of digital pathology.
Keywords: Histology; Computed Tomography; Multimodal Fusion; Digital Image Processing
Deutsch
Die histologische Analyse ist aktuell der Goldstandard zur Charakterisierung von Hart- und Weichgewebe auf zellulärer Ebene in der klinischen Routine und biomedizinischen Forschung. Nach der Extraktion des Gewebes mittels beispielsweise einer Biopsie, wird dieses fixiert, chemisch getrocknet und in einem infiltrierenden Medium wie Kunstharz oder Paraffin eingebettet. Durch spezielle Schnittverfahren können aus den generierten Blöcken dünne Schichten isoliert und gefärbt werden. Diese Färbungen markieren spezifische Zellpopulationen und Bestandteile der extrazellulären Matrix, wobei in den meisten Fällen die Entfernung des Matrixmaterials erforderlich ist. Der gefärbte Schnitt wird anschließend mittels Mikroskopie digitalisiert, wodurch eine Analyse des Gewebes durch den Einsatz von modernen Bildverarbeitungsmethoden ermöglicht wird. Aus diesem Verfahren ergeben sich die folgenden Nachteile: i) das Probenmaterial wird irreversibel verändert oder zerstört, ii) die generierten Daten sind inhärent zweidimensional (2D), iii) aufgrund der arbeitsintensiven Aufbereitung wird in der Regel nur ein begrenzter Teil der Probe untersucht, iv) der Schnittprozess zielt nicht präzise auf bestimmte Regions of Interest (ROI) ab, und v) das Schnittverfahren kann Verformungen im Gewebe verursachen. In der aktuellen Literatur wurde die histologische Routine durch den Einsatz von Mikro-Computertomographie (microCT) erweitert, wodurch die dreidimensionale (3D) morphologische Analyse des Gewebes vor dem Schnitt durchgeführt werden kann. Zudem ergibt sich so die Möglichkeit zur Fusion der histologischen Mikroskop-Aufnahmen mit der holistischen 3D in silico Repräsentation der Probe. Ein wesentlicher Bestandteil dieses multimodalen Fusionsprozesses ist die präzise Lokalisierung des 2D-Schnitts im 3D-Kontext durch Bildregistrierung. Basierend auf den spezifischen Merkmalen in beiden Bildern, wie den lokalen Pixelintensitätswerten, wird eine geometrische Transformation mit unterschiedlichen Freiheitsgraden berechnet, um eine genaue Überlagerung zu ermöglichen. Abhängig von der Verarbeitung des Gewebes mit entweder einer pathologischen Säge oder einem Mikrotom können zunehmend schwerwiegendere Verformungen auftreten, die komplexere Registrierungsalgorithmen erfordern. Das Ziel der vorliegenden Dissertation ist die Optimierung der etablierten histologischen Routine in der klinischen Praxis und Forschung durch i) multimodale Bildfusion und der weiterführenden Analyse höherdimensionaler Merkmale und ii) die Verbesserung der Schnitttechniken für Hart- und Weichgewebe, um eine gezielte Co-Registrierung beider Modalitäten zu vereinfachen. Auf der Basis der multimodalen Fusion habe ich Methoden zur Verbesserung der Schnittführung und Analyse von Gewebeproben mitentwickelt, und so den gewonnenen Informationsgehalt erweitert. Der Einsatz von 3D-gedruckten Phantomen, die zusammen mit Hartgewebeproben in Kunstharz eingebettet wurden, ergab eine unabhängige Lösung zur Korrelation identischer Schnitte in microCT und histologischer Bildgebung. Zum einen konnte dadurch ein Qualitätskontrollmechanismus etabliert werden, zum anderen ermöglichte dies die präzise geometrische Fusion beider bildgebenden Verfahren. Darüber hinaus habe ich zur Schaffung eines multimodalen Workflows beigetragen, basierend auf der Korrelation von Synchrotron Phasenkontrast-Mikro-Computertomographie-Scans (SRμCT) und Mikroskop-Aufnahmen von Darmkrebsproben. Während Weichgewebe in der klassischen microCT-Bildgebung einen geringen Röntgenkontrast aufweisen, konnten wir durch SRμCT hochaufgelöste Scans (Pixelgröße 2 µm) der Proben mit zufriedenstellenden Kontrast generieren. Aufgrund der komplexen Verformungen in den mit einem Mikrotom erzielten Schnitten wurde der Einsatz von elastischen Registrierungsalgorithmen notwendig, um zusätzliche Scherungsartefakte auszugleichen. Hierbei wurden farbkodierte Informationen aus den 2D-Schnitten in den 3D-Scan übertragen und höherdimensionale Merkmale segmentiert. Darüber hinaus ermöglichten microCT-Scans die Lokalisierung von ROIs im gescannten Gewebe. Ich habe das microCT-Koordinatensystem genutzt, um i) den Schnitt für Proben aus Hartgewebe zu planen und ii) den Schnittprozess durch die Entwicklung und Implementierung eines Positioniersystems zu automatisieren, wodurch das bislang manuelle Verfahren verbessert, und die Generierung multimodaler Datensätze ermöglicht werden kann. Zusammenfassend wurden mit Hilfe der Ergebnisse dieser Dissertation die etablierten histologischen Routinen und die damit verbundene Analyse der Daten erweitert, indem diese durch den 3D-Kontext ergänzt wurden. Beispielsweise wurde dies durch die Nutzung von 3D-gedruckten Markern für die unabhängige multimodale Korrelation und Entwicklung eines computerunterstütztem Schnittverfahrens umgesetzt. Diese Ergebnisse können zur Optimierung von klinischen und wissenschaftlichen Anwendungen hinsichtlich der Anzahl und Qualität der erzeugten histologischen Daten beitragen und als grundlegende Prozesse für die Generierung von korrelierten Datensätzen im Bereich der digitalen Pathologie eingesetzt werden.
Schlagwörter: Histology; Computed Tomography; Multimodal Fusion; Digital Image Processing