Analyse der ARHGAP29-abhängigen Signalisierung der Invasion von Mammakarzinomzellen

Analysis of ARHGAP29-dependent signaling in breast cancer cell invasion

by Maike Kansy
Doctoral thesis
Date of Examination:2024-04-18
Date of issue:2024-04-08
Advisor:Prof. Dr. Carsten Gründker
Referee:Prof. Dr. Carsten Gründker
Referee:Prof. Dr. Heidi Hahn
Referee:Prof. Dr. Thomas Meyer
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10434

 

 

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Abstract

English

Despite expanded early detection examinations and improved treatment options, breast cancer remains the most common cause of death from cancer in women worldwide. Fundamental to the development of innovative therapies is an understanding of mechanisms and signaling pathways that play a role in the invasion and metastasis of cancer cells. Rho GTPases and their modulating proteins, such as GTPase-activating proteins (GAPs) often show increased expression in malignant tumors. In breast cancer RhoA and RhoC were found to be overexpressed. RhoA is attributed both tumor-suppressive and oncogenic properties while RhoC shows a central role in tumor progression. ARHGAP29 (a GTPase-activating protein) is also overexpressed in mesenchymal-transformed breast cancer cells and in aggressive triple negative breast cancer (TNBC). Using immunofluorescence on a tissue microarray (TMA) with tissue samples from benign mammary gland and breast cancer tissue we showed an increased expression of ARHGAP29 in carcinoma tissue compared to normal mammary gland tissue. Furthermore, there were indications of a possible correlation between high ARHGAP29 expression and advanced tumor stage. In addition to its possible function as a prognostic marker, an influence of ARHGAP29 on invasion of breast cancer cells has been described in literature. The underlying signaling pathways have not yet been clarified. In earlier studies AKT1 was identified as a possible interaction partner. To identify further signaling pathways around ARHGAP29, breast cancer cell lines HCC1806, T-47D-EMT and MCF-7-EMT were examined using transient siRNA transfection, western blot analysis and spheroid invasion assay focusing on possible signaling pathways between ARHGAP29, RhoC and pAKT1. Knockdown of ARHGAP29 indicated a rather indirect interaction between ARHGAP29 and RhoC using for example feedback mechanisms. Effects on the activity of AKT were clearer. Knockdown of RhoC led to a decreased expression of pAKT1 (the active form of AKT1), while the expression of pAKT1 did not change after knockdown of ARHGAP29. Earlier publications had shown a decreased expression of the inactive form (= AKT1) after ARHGAP29 knockdown. Whether a reduced invasion of ARHGAP29-reduced spheroids in the invasion assay is related to altered activity of AKT1 therefore remains unclear. A knockdown of RhoC in the spheroid assay led to only a slight decrease in invasion but showed a more pronounced reversibility by activation of AKT1 using synthetic AKT-activator SC79 than the spheroids in ARHGAP29 knockdown. This matches the results of knockdown of RhoC resulting in a decreased pAKT1 expression. Overall signaling pathways surrounding Rho GTPases and AKT appear to be subject to great complexity and context dependency. Therefore further research is needed to break down the exact signaling pathways involving ARHGAP29.
Keywords: ARHGAP29; triple negative breast cancer; rho GTPases; breast cancer; epithelial mesenchymal transition; EMT; ARHGAP 29; GTPase activating proteins; invasion; AKT1; RhoC

German

Das Mammakarzinom bleibt, trotz ausgeweiteter Früherkennungsmaßnahmen und verbesserter Therapiemöglichkeiten, die häufigste Todesursache weltweit unter den Krebserkrankungen bei Frauen. Die Entwicklung innovativer Therapien, insbesondere für die Behandlung von aggressiven und schon fortgeschrittenen Mammakarzinomerkrankungen sind deshalb weiterhin wichtiger Bestandteil aktueller Forschung. Grundlegend hierfür ist ein Verständnis von Mechanismen und Signalwegen, die eine Rolle bei der Invasion und Metastasierung von Mammakarzinomzellen spielen. RhoGTPasen und ihre modulierenden Proteine, wie beispielsweise GTPase-activating proteins (GAPs) zeigen häufig eine veränderte Aktivität oder Expression in malignen Tumoren. Im Mammakarzinom zeigten sich besonders RhoA und RhoC als überexprimiert. Während RhoA kontextspezifisch sowohl tumorsuppressive als auch onkogene Eigenschaften zugeschrieben werden, zeigt vor allem RhoC eine zentrale Rolle bei der Tumorprogression des Mammakarzinoms. Auch ARHGAP29, ein GTPase-activating protein ist in mesenchymal-veränderten Brustkrebszellen und im aggressiven triple negative breast cancer (TNBC) überexprimiert. Bei der Untersuchung eines Tissue Microarrays (TMA) mit Gewebeproben aus benignem Brustdrüsen- und Mammakarzinomgewebe mittels Immunfluoreszenz, zeigte sich eine verstärkte Expression von ARHGAP29 im Karzinomgewebe im Vergleich zum normalen Brustdrüsengewebe. Zudem ergaben sich Hinweise auf eine mögliche Korrelation zwischen hoher ARHGAP29-Expression und fortgeschrittenem Tumorstadium. Neben der möglichen Funktion als prognostischer Marker wurde in der Literatur ein Einfluss von ARHGAP29 auf die Invasionseigenschaften von Mammakarzinomzellen beschrieben. Über welche Signalwege ARHGAP29 dabei wirkt, ist bisher nicht geklärt. Als möglicher Interaktionspartner von ARHGAP29 bei der Invasion von Mammakarzinomzellen wurde in früheren Arbeiten die AKT1 identifiziert. Um weitere Signalwege und Interaktionspartner von ARHGAP29 aufzuzeigen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Mammakarzinomzellen der Linien HCC1806, T-47D-EMT und MCF-7-EMT mittels transienter siRNA-Transfektion, Western Blot Analyse und Sphäroid-Invasionsassay untersucht. Im Fokus standen dabei mögliche Signalkaskaden zwischen ARHGAP29, RhoC und pAKT1. Ein knockdown von ARHGAP29 ergab Hinweise auf eine eher indirekte Interaktion von ARHGAP29 mit RhoC, zum Beispiel über Feedback-Mechanismen. Deutlicher zeigten sich Auswirkungen auf die Aktivität der AKT. Ein knockdown von RhoC führte zu einer Abnahme der pAKT1-Expression, während sich die Expression der aktiven Form der AKT1 (= pAKT1) nach knockdown von ARHGAP29 nicht veränderte. Frühere Publikationen hatten eine Abnahme der Expression der inaktiven Form (= AKT1) nach ARHGAP29-knockdown ergeben. Ob eine verminderte Invasion ARHGAP29-reduzierter Sphäroide im Invasionsassay mit der AKT1 zusammenhängt, bleibt daher nicht abschließend geklärt. Ein knockdown von RhoC führte nur zu einer leichten Abnahme der Invasion im Sphäroidassay, zeigte jedoch eine deutlichere Reversibilität durch Aktivierung von AKT1 mittels synthetischem AKT-Aktivator SC79 als die Sphäroide nach ARHGAP29-knockdown. Dies bestätigt die Ergebnisse aus der siRNA-Transfektion von RhoC mit Abnahme der pAKT1-Expression. Insgesamt scheinen Signalwege um RhoGTPasen und AKT einer großen Komplexität und Kontextabhängigkeit zu unterliegen, weshalb es bei der genauen Aufschlüsselung der Signalwege um ARHGAP29 weiterführender Forschung bedarf.
 
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