Die Entwicklung von Nanobody-funktionalisierten Goldoberflächen
The development of nanobody-functionalized gold surfaces
by Cornel Munsch
Date of Examination:2024-04-18
Date of issue:2024-04-15
Advisor:Prof. Dr. Silvio Rizzoli
Referee:Prof. Dr. Markus Bohnsack
Referee:Prof. Dr. Thomas Meyer
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10446
Files in this item
Name:dissertation cornel munsch SUB .pdf
Size:3.17Mb
Format:PDF
The following license files are associated with this item:
Abstract
English
Atomic force microscopy enables three-dimensional imaging of samples. The use of antibodies to improve the accuracy of microscopy is an established method. An antibody can be linked to the golden tip of an atomic force microscope (AFM). Single-domain antibodies, so-called nanobodies, are superior to conventional antibodies in several aspects and could improve atomic force microscopy. This work aims to establish a method to covalently bind the nanobody anti-green fluorescent protein (GFP) to a gold surface and visualize the antigen GFP on that gold surface by using a confocal microscope. In order to achieve this goal, the nanobody was coupled to the linker maleimide-polyethanol glycol(4)-dibenzocyclooctyne by using click chemistry. One part of this product was coupled to the dye Star 635P and was successfully tested in immunostainings and in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. The gold surface had to be amino- and azide-functionalized before the linker-functionalized nanobody could bind to the gold surface. The dibenzocyclooctyne-functionalized nanobody anti-GFP bound covalently to the gold surface by reacting with its azide-groups. Confocal microscopy provided proof of the succefull functionalization by imaging the antigen green fluorescent protein bound to the nanobody-functionalized gold surface. In further experiments, renewed functionalization of gold surfaces and AFM tips should be carried out, which will be verified using microscopy and AFM measurements. Subsequent experiments could show that AFM measurements with nanobodies are superior to conventional antibody-based measurements.
Keywords: Nanobody
German
Die Rasterkraftmikroskopie ermöglicht eine dreidimensionale Darstellung von Proben. Dabei ist es eine etablierte Methode, dass mithilfe von Antikörpern die Genauigkeit dieser Mikroskopie verbessert wird. Dafür kann zum Beispiel ein Antikörper an die goldene Spitze eines Rasterkraftmikroskops (atomic force miroscope (AFM)) gekoppelt werden. Einzeldomänenantikörper, sogenannte Nanobodies, sind den herkömmlichen Antikörpern in mehrfacher Hinsicht überlegen und könnten die Rasterkraftmikroskopie weiter verbessern. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu etablieren, mit der der Nanobody anti-green fluorescent protein (GFP) kovalent an eine Goldoberfläche gebunden wird, und das gebundene Antigen GFP mithilfe eines Konfokalmikroskops auf der Goldoberfläche darzustellen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde der Nanobody mit Hilfe von Click-Chemie an den linker Maleimid-Polyethanol Glykol(4)-Dibenzocyclooctin gekoppelt. Ein Teil dieses Produktes wurde an den Farbstoff Star 635P gekoppelt und sowohl in Immunfärbungen als auch in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis erfolgreich getestet. Damit der linker-funktionalisierte Nanobody an eine Goldoberfläche binden konnte, musste diese zuvor aminofunktionalisiert und anschließend azidfunktionalisiert werden. Durch die Reaktion zwischen dem Dibenzocyclooctin und der azidfunktionalisierten Goldoberfläche konnte der Nanobody anti-GFP kovalent an die Goldoberfläche gekoppelt werden. Mithilfe der Konfokalmikroskopie konnte der erfolgreiche Nachweis der Funktionalisierung erbracht werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass das Antigen green fluorescent protein auf der Nanobody-funktionalisierten Goldoberfläche, auch nach mehrfachen Waschvorgängen, gebunden wurde. In weiterführenden Versuchen sollten erneute Funktionalisierungen von Goldoberflächen und AFM-Spitzen, die mithilfe von Mikroskopie und AFM-Messungen überprüft werden, durchgeführt werden. Anschließende Untersuchungen könnten zeigen, dass AFM-Messungen mit Nanobodies den herkömmlichen, auf Antikörper basierenden Messungen überlegen sind.
Schlagwörter: Nanobody; Einzeldomänenantikörper
