| dc.contributor.advisor | Meyer, Thomas Prof. Dr. | |
| dc.contributor.author | Petersen, Jana | |
| dc.date.accessioned | 2020-05-07T12:13:44Z | |
| dc.date.available | 2020-08-14T22:50:03Z | |
| dc.date.issued | 2020-05-07 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/21.11130/00-1735-0000-0005-138F-5 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7960 | |
| dc.language.iso | deu | de |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | |
| dc.subject.ddc | 610 | de |
| dc.title | Die Bedeutung der Coiled-coil-Domäne für die Inaktivierung des Transkriptionsfaktors STAT1 | de |
| dc.type | doctoralThesis | de |
| dc.title.translated | The role of the coiled-coil domain in inactivation of the transcriptionfactor STAT1 | de |
| dc.contributor.referee | Meyer, Thomas Prof. Dr. | |
| dc.date.examination | 2020-05-26 | |
| dc.description.abstractger | Heterozygote Gain-of-Function(GOF)-Mutationen im Transkriptionsfaktor STAT1 (Signaltransduktor und Aktivator der Transkription 1) resultieren in einer vermehrten Expression von zytokinregulierten Zielgenen. Durch diese transkriptionelle Überaktivität und die damit verbundene fehlgeleitete Immunantwort kann es zum Ausbruch einer chronischen mukokutanen Candidiasis kommen (CMC). Über die zu Grunde liegende molekularen Mechanismen dieser pathogenen Missense-Mutationen ist bisher wenig bekannt. Die als CMC-Auslöser bekannte STAT1-GOF-Mutation R274W und ein nach Alanin mutierter benachbarter Glutaminrest an Position 275 wurden in dieser Arbeit genauer charakterisiert. Beide hier generierten Substitutionsmutanten zeigten ein erhöhtes Tyrosin-Phosphorylierungsniveau, eine verlängerte nukleäre Akkumulationsdauer und eine gesteigerte transkriptionelle Aktivität nach Stimulation der Zellen mit Interferon-γ(IFNγ). In Versuchen zur DNA-Dissoziationskinetik und sequenzspezifischem Bindungsverhalten mit hoch-affinen STAT1-Bindestellen, sogenannten gamma-activated-sites (GAS), ergaben sich zwischen den STAT1-Mutanten und dem Wildtyp-Molekül keine Unterschiede. Weiterhin zeigten die in der Coiled-coil-Domäne lokalisierten Punktmutanten ein normales Tetramerisierungsverhalten. Unvorhergesehener weise haben sich keine Unterschiede im Dephosphorylierungs-Assay mit STAT1-spezifischer TC45-Phosphatase zwischen den mutierten Varianten und dem Wildtyp-Protein aufgetan. Die STAT1-GOF-Mutanten R274W und Q275A ließen sich im Gegensatz zu anderen, bereits näher charakterisierten GOF-Mutationen, einwandfrei durch die TC45-Phosphatase dephosphorylieren. In Anwesenheit von doppelsträngigen GAS-Proben waren die STAT1-Mutanten sowie das Wildtyp-Protein vor Inaktivierung geschützt. Darüber hinaus ließen sich auch in einem Phosphorylierungs-Assay mit Janus-Kinase 2 (JAK2) keine Unterschiede in kinetischen Messungen dokumentieren, so dass der Phänotyp dieser Mutanten weder aus einem TC45-katalysierten Dephosphorylierungsdefekt noch aus einer gesteigerten JAK-induzierten Aktivierung am Rezeptor resultiert. Die Ergebnisse aus einem Experiment zum nukleären Akkumulationsverhalten unterstützen die Annahme, dass die beiden hyperphosphorylierten Mutanten R274W und Q275A als Systemmutationen anzusehen sind. Nach nur 10-minütiger Stimulation mit IFN-γ eine vollständige Kernakkumulation dieser zwei Mutanten fluoreszenzmikroskopisch ersichtlich, wohingegen das Wildtyp-Molekül zu diesem frühen Zeitpunkt noch vorwiegend im Zytoplasma lokalisiert war. Die kritischen Aminosäurereste an Position 274 und 275 liegen im Zentrum der Interaktionsfläche zweier STAT1-Protomere in antiparalleler Konformation. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit wird ein hypothetisches Modell vorgestellt, in dem ein (unphosphoryliertes) STAT1-Molekül einen trimeren Komplex mit einem parallelen Phospho-STAT1-Dimer bildet, der den Kernimport inhibiert. Kommt es durch eine GOF-Mutation an dieser interdimerischen Interaktionsfläche zur Instabilität der hypothetischen trimeren Komplexes, resultiert dies in einer vorzeitigen Kernakkumulation und führt durch DNA-Bindung zu einem Schutz vor enzymatischer Dephosphorylierung durch die STAT1-spezifische TC45-Phosphatase. | de |
| dc.description.abstracteng | Heterozygous gain-of-function (GOF) mutations in the transcription factor STAT1 (signal transductor and activator of transcription 1) result in increased expression of cytokine-regulated target genes. The abnormally high transcriptional activation mediated by these mutants usually results in misdirected immune responses and the development of chronic mucocutaneous candidiasis (CMC). However, little is known about the underlying molecular mechanisms mediated by these pathogenic missense mutations. The CMC-associated GOF mutation R274W and a substitution mutation of the neighboring glutamine residue at position 275 were further characterized in this study. Upon stimulation of cells with interferon-γ(IFNγ), the two substitution mutants displayed an increased tyrosine phosphorylation level, a prolonged nuclear accumulation and an increased transcriptional response. Kinetic studies on DNA dissociation from high-affinity binding elements, known as gamma-activated sites (GAS), and sequence-specific binding to DNA revealed no differences between the mutant and wild-type molecules. Furthermore, the two point mutants localized in the coiled-coil domain showed normal tetramer stability on DNA. Unexpectedly, there were no differences in an in vitro dephosphorylation assay using the STAT1-specific TC45 phosphatase between the STAT1 variants. In contrast to other previously characterized GOF mutations, the STAT1 GOF mutants R274W and Q275A were normally dephosphorylated by the phosphatase, and, in the presence of double-stranded GAS sites, all STAT1 variants were protected from TC45-catalyzed enzymatic inactivation. In addition, no differences were found in a phosphorylation assay with Janus kinase 2 (JAK2), excluding that the phenotype of these mutants results either from a TC45-catalyzed dephosphorylation defect or from increased JAK-induced activation. Results from a nuclear accumulation experiment support the assumption that the two hyperphosphorylated mutants R274W and Q275A must be regarded as system mutants. Already 10 minutes after stimulation of the cells with IFNγ complete nuclear accumulation of the two GOF mutants was achieved, whereas at this early time point, the wild-type molecule was still predominantly located in the cytoplasm. The two critical amino acid residues 274 and 275 are located in the center of the binding interface between two STAT1 protomers aligned in antiparallel conformation. Based on the results from this study, a hypothetical model is presented in which an unphosphorylated STAT1 molecule forms a trimeric complex with a parallel phosphodimer, which inhibits its own nuclear import by masking a dimer-specific nuclear localization signal in the two DNA-binding domains. A GOF mutation localized at the interdimeric interaction surface may destabilize the hypothetical trimeric complex, resulting in premature nuclear accumulation and DNA binding of dimeric STAT1, which is then protected against enzymatic dephosphorylation by the inactivating TC45 phosphatase. | de |
| dc.contributor.coReferee | Lutz, Susanne Prof. Dr. | |
| dc.subject.ger | STAT1 | de |
| dc.subject.ger | Coiled-coil-Domäne | de |
| dc.subject.eng | STAT1 | de |
| dc.subject.eng | coiled-coil domain | de |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-21.11130/00-1735-0000-0005-138F-5-8 | |
| dc.affiliation.institute | Medizinische Fakultät | de |
| dc.subject.gokfull | GOK-MEDIZIN | de |
| dc.description.embargoed | 2020-08-14 | |
| dc.identifier.ppn | 1697712061 | |