The DNA damage kinases MK2, Chk1 and the chromatin remodeling factor CHD8 determine the cellular outcome after replicative stress and DNA damage

by Anna Maria Binkowski
Doctoral thesis
Date of Examination:2021-04-15
Date of issue:2021-03-26
Advisor:Prof. Dr. Matthias Dobbelstein
Referee:Prof. Dr. Matthias Dobbelstein
Referee:PD Dr. Elisabeth Heßmann
Referee:Prof. Dr. Thomas Meyer
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8524

 

 

Files in this item

Name:SUBversion_Binkowski_CHD8_DNA-Damage.pdf
Size:3.79Mb
Format:PDF

The following license files are associated with this item:

Abstract

English

DNA damage occurs and accumulates in every cell and is cause and consequence of cancerogenesis. Massive induction of exogenous DNA damage has its use in chemotherapy as it causes growth arrest and apoptosis in malignant cells. The cellular response to replicative stress and DNA damage consists of a signaling network called DNA damage response. The chemotherapeutic drug gemcitabine is a nucleoside analog selectively acting during S-phase of the cell cycle and therefore affects mainly highly proliferative cells like in tumors. Its main application is the treatment of pancreatic cancer, which is characterized by poor therapeutic response and fast development of chemoresistance. Manipulating DNA damage and repair pathways in order to sensitize tumors to this drug has been part of many clinical trials. The knockdown or inhibition of the DNA damage effector kinase Chk1 highly activates the DNA damage response and apoptosis. Another kinase, MK2, was previously identified in our lab as antagonist of Chk1 in the response to DNA replicative stress caused by gemcitabine. In the first part of this work, the antagonism of the two kinases MK2 and Chk1 was established as determinant of the sensitivity to gemcitabine in a variety of pancreatic cancer cell lines. Interestingly, the inhibition of Chk1 induces apoptosis only in one cell line while it mediates chemoresistance to gemcitabine in the others. This remarkable observation adds a new aspect to the criticism of Chk1 inhibitors as cancer therapeutics. The second part of this work focuses on identifying new determinants of the gemcitabine response. To this end, a high throughput screen in gemcitabine-treated pancreatic cancer cells was performed using RNA-interference to deplete cells of 551 gene products which have a previously assigned function in the DNA damage response and genomic integrity. The screen identified the chromatin remodeling factor CHD8 to protect cells from the early consequences of gemcitabine treatment. Its knockdown causes the accumulation of DNA damage and apoptosis markers after replicative stress induced by gemcitabine and ultraviolet radiation as well as after DNA double strand breaks induced by neocarzinostatin. In contrast to these seemingly chemosensitizing effects, cells depleted of CHD8 obtained a growth advantage through faster recovery after gemcitabine treatment. The transcriptional expression of a number of factors involved in the DNA damage response was found to be influenced by CHD8, as demonstrated by microarray analysis. These effects are independent of the presence or functionality of the tumor suppressor p53, whose mRNA expression as well as protein levels are diminished in CHD8-depleted cells. Remarkably, CHD8-depletion can also reduce the abundance of oncogenic mutant p53. This is of clinical relevance because there are only few ways known to achieve this reduction. In summary, we identify CHD8 as a modulator of chemosensitivity with influence on the expression of central DNA damage response genes.
Keywords: DNA damage; CHD8; Chk1; MK2; Gemcitabine; Chromatin remodelling; chemotherapy; replicative stress; pankreatic cancer; p53

German

DNA-Schäden sind Ursache und Folge der Krebsentstehung. Gleichzeitig bewirkt die Induktion von DNA-Schäden als Folge von Chemotherapie einen Wachstumsstopp und induziert Apoptose in Tumorzellen. Die zelluläre Antwort auf replikativen Stress und DNA-Schäden besteht aus einem Netzwerk von Signalkaskaden, der DNA Damage Response. Gemcitabine wirkt als Nucleosidanalogon selektiv in der S-Phase des Zellzyklus und daher besonders in hochproliferativen Geweben wie Tumoren. Es findet seine hauptsächliche Anwendung in der Therapie des Pankreaskarzinoms, einem Tumor, der allerdings durch schlechtes Therapieansprechen und schnelle Resistenzwicklung gegen Gemcitabin charakterisiert ist. Die medikamentöse Manipulation von DNA damage signaling und DNA-Reparaturmechanismen zur Verstärkung der Gemcitabinwirkung zu nutzen, ist bereits Gegenstand zahlreicher Studien. In dem Zusammenhang bewirkt der Knockdown oder die Inhibition der DNA Damage-Kinase Chk1 eine starke DNA Damage Response und Apoptose. Eine weitere Kinase, MK2, wurde bereits als Antagonist von Chk1 in der Antwort auf replikativen Stress nach Gemcitabine beschrieben. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Antagonismus zwischen MK2 und Chk1 wirkungsvoll als Determinante der Gemcitabinantwort in verschiedenen Pankreaskarzinommodellen etabliert. Bemerkenswerterweise bewirkte die Inhibition von Chk1 allerdings nur in einer Zelllinie die Induktion von Apoptose, während es in den anderen Zelllinien eher eine Resistenz gegenüber der Gemcitabinbehandlung vermittelt, eine Beobachtung, welche die Verwendung von Chk1-Inhibitoren als Chemosentizer kritisch beleuchtet. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Identifikation neuer Determinanten der Gemcitabinantwort. Dazu wurde ein Hochdurchsatz-Screen in gemcitabinbehandelten Pankreaskarzinomzellen optimiert und durchgeführt, für den mittels RNA-Interferenz 551 in der DNA damage response bekannte Genprodukte depletiert wurden. Der hierbei identifizierte Chromatin Remodelling Faktor CHD8 schützt die Zellen vor frühen Effekten der Gemcitabinbehandlung. Sein Knockdown bewirkt die Akkumulation von DNA damage- sowie Apoptosemarkern nach replikativem Stress durch Gemcitabine oder UV-Licht, aber auch nach DNA Doppelstrangbrüchen, die durch das Radiomimetikum Neokarzinostatin bewirkt werden. Im Kontrast zu dem initial scheinbar chemosensitivierenden Effekt des CHD8-Knockdowns erhalten depletierte Zellen langfristig erstaunlicherweise einen Wachstumsvorteil. CHD8 beeinflusst die Expression einiger DNA Damage-Faktoren, wie über eine Microarray-Hybridisierung gezeigt werden konnte. All diese Effekte sind unabhängig von der Anwesenheit von funktionalem Tumorsuppressors p53, dessen mRNA- und Proteinlevel nach CHD8-Knockdown vermindert sind. Bemerkenswerterweise kann CHD8-Depletion auch den Überschuss an mutiertem p53 in den entsprechenden Zellen reduzieren, was insbesondere aufgrund der zahlreichen onkogenen Funktionen von mutiertem p53 von großer klinischer Relevanz ist. Bisher sind nur wenige Mechanismen bekannt, eine Reduktion von onkogenem p53 zu erreichen. Zusammenfassend beschreiben wir CHD8 als Modulator der Chemosensitivität mit Einfluss auf die zelluläre Expression zentraler DNA Damage Response-Gene.
 
Statistik