| dc.contributor.advisor | Lipka, Volker Prof. Dr. | |
| dc.contributor.author | Wagenknecht, Lena | |
| dc.date.accessioned | 2021-08-05T13:34:49Z | |
| dc.date.available | 2022-07-13T00:50:11Z | |
| dc.date.issued | 2021-08-05 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/21.11130/00-1735-0000-0008-58D0-A | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8770 | |
| dc.language.iso | eng | de |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | |
| dc.subject.ddc | 570 | de |
| dc.title | Towards the identification and functional characterization of molecular components involved in PEN2-mediated entry control of non-adapted powdery mildews in Arabidopsis | de |
| dc.type | doctoralThesis | de |
| dc.contributor.referee | Lipka, Volker Prof. Dr. | |
| dc.date.examination | 2021-07-15 | |
| dc.description.abstractger | Die Cytochrome P450 Monooxygenase CYP81F2 und die atypische Myrosinase PENETRATION2 (PEN2) sind bedeutende Komponenten der präinvasiven Resistenz von Arabidopsis thaliana gegen filamentöse Pathogene (Lipka et al., 2005; Bednarek et al., 2009; Clay et al., 2009; Fuchs et al., 2016). PEN2 ist ein C-terminal verankertes Membranprotein und ist in der Peripherie von Mitochondrien und Peroxisomen lokalisiert (Lipka et al., 2005; Fuchs et al., 2016). Infektionsex-perimente mit dem nicht-adaptierten Mehltaupilz Blumeria graminis f.sp hordei (Bgh) zeigten eine Akkumulation und Immobilisierung von mitochondrialen Subpopulationen an der Interaktionsstelle. Des Weiteren, bildeten sich PEN2-Aggregate an der äußeren Mitochondrienmembran von immobilisierten Mitochondrien, direkt unter der versuchten Invasionsstelle des Mehltaupilzes (Fuchs et al., 2016). Fuchs et al., 2016 zeigten, dass PEN2 nach Mehltauinfektion detergenz-resistente Oligomere und Dimere ausbildete. Die Cytochrome P450 Monooxygenase CYP81F2 ist am Endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert und akkumuliert in infizierten Zellen. Nach Pilzinokulation reorganisierte sich das ER in direkter Nähe der immobilisierten Mitochondrien an Stellen der versuchten Invasion (Fuchs et al., 2016). CYP81F2 ist an der Synthese von 4MI3G beteiligt, welches das Substrat der Myrosinase PEN2 ist und für die präinvasive Resistenz der Pflanze benötigt wird. PEN2 katalysiert die Hydrolyse von 4MI3G (Bednarek et al., 2009; Clay et al., 2009). Die Hydrolyse von 4MI3G führt zu der Bildung von toxischen Sekundärmetaboliten, die von dem ABC-Transporter PEN3 in den Apoplasten transportiert werden, um die versuchte Invasion des Pilzes abzuwehren (Stein et al., 2006; Matern et al., 2019).
Die Pathogen-induzierte und zellautonome Abwehrmechanismen basieren vermutlich auf der Perzeption des potentiellen Pathogenes. Um die Verbindung zwischen der Erkennung des Pathogens und der PEN2-vermittelten präinvasiven Resistenz genauer zu untersuchen, konzentriert sich der erste Teil dieser Studie auf die Analyse der MAMP-abhängigen CYP81F2 Akkumulation, ER Reorganisation, Akkumulation von Mitochondrien, sowie der PEN2 Aggregatbildung. CYP81F2 akkumulierte am ER und an der Zellkernhülle nach Chitin- und Flagellin-Infiltration. Ähnlich wie bei Mehltaupilzen rufen MAMPs die Akkumulierung von Mitochondrien, sowie die PEN2-Aggregatbildung an immobilisierten Mitochondrien hervor. Darüber hinaus wurden nach MAMP-Behandlung auch einzelne, mobile Mitochondrien mit stark fluoreszierenden PEN2-Aggregaten beobachtet. Immobilisierung oder PEN2-Aggregatbildung an Peroxisomen trat nach MAMP-Behandlung nicht auf.
Der Zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Identifizierung und Charakterisierung von weiteren molekularen Komponenten die an der PEN2-vermittelten präinvasiven Resistenz beteiligt sind. Um solche Komponenten zu identifizieren wurde eine homozygote transgene Linie generiert, die PEN2-GFP-TAPEN2 and CYP81F2-mKate2 von einer Kassette exprimiert. Die T-DNA Insertion befindet sich in keiner kodierenden Sequenz. Konfokale Laserscanningmikroskopie Analysen zeigten die erwartete subzelluläre Lokalisation von GFP-markiertem PEN2 und mKate2-markiertem CYP81F2 nach Pilzinfektion. Die selektierte Linie kann in weiteren Studien für einen vorwärtsgerichteten-genetischen und Konfokalmikroskopie-basierten Screen verwendet werden, um weitere Komponenten der CYP81F2/PEN2- vermittelten präinvasiven Resistenz zu identifi-zieren.
Die Glutathione-S-transferase class-tau member 13 (GSTU13) wurde als weitere wichtige Komponente der präinvasiven Resistenz von Arabidopsis identifiziert (Piślewska-Bednarek et al., 2018). Es wird angenommen, dass die Glutathiontransferase das Indol-3-ylmethyl-isothiocyanat (I3G-ITC) und das 4-Methoxyindol-3-ylmethyl-isothiocyanat (4MI3G-ITC) mit Glutathion konjugiert und an der Biosynthese von Indol-3-ylmethyl amin (I3A), Raphanusamsäure (RA) und 4-O-β-d-glucosyl-indol-3-yl formamid (4OGlcI3F), welche mögliche Endprodukte der PEN2-vermittelten präinvasiven Immunantwort sind, beteiligt ist (Piślewska-Bednarek et al., 2018). Konfokalmikroskopische Analysen zeigten, dass N-und C-terminal RFP-markiertes GSTU13 im Zytosol, Zellkern und in runden Strukturen lokalisiert ist. Diese runden Strukturen zeigten keine Kolokalisation mit PEN2-GFP-TAPEN2-positiven Membrankompartimenten. Nach Pilzinfektion akkumulierte nicht nur das Zytoplasma an der Interaktionsstelle, sondern es zeigte sich eine erhöhte GSTU13-RFP Fluoreszenz unterhalb der versuchten Penetrationstelle.
Es wurde gezeigt, dass molekulare Komponenten, der präinvasiven Resistenz von Arabidopsis mit PEN2 und PEN3 koexprimiert sind (Humphry et al., 2010). Um weitere molekulare Komponenten zu identifizieren, die an der PEN2-vermittelten präinvasiven Resistenz beteiligt sind, wurden in dieser Arbeit, zwei koexprimierte Gene, AT1G08930 (Early response to dehydration 6 (ERD6)) und AT1G55450 (S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase; genannt SAM-MT) für weitere Analysen ausgewählt.
Der vorhergesagte Saccharose-Transporter ERD6 ist an der präinvasiven Resistenz gegen den nicht-adaptierten Mehltaupilz Erysiphe pisi beteiligt, trägt jedoch nicht zur Abwehr gegen Bgh und Golovinomyces orontii bei. Konfokalmikroskopische Analysen von unbehandelten Epidermiszellen zeigten das mTurquoise2-markiertes ERD6 mit multiversikularen Körpern assoziiert ist und auch in der Vakuole lokalisiert. Nach E. pisi Infektion akkumulierten ERD6-positive Vesikel an dem Ort der versuchten Invasion und in der Nähe von immobilisierten Mitochondrien, die mit PEN2-Aggregaten assoziiert sind. Eine ungerichtete Metaboliten-Analyse zeigte eine Akkumulati-on des PEN2/CYP81F2 Substrats I3G, des IGMT1/IGMT2-Substrats 4OHI3G, und des PEN2-Substrats 4MI3G, sowie der glykosylierten Form von Dihydroascorbigen in der erd6 Mutante, was auf einem möglichen ERD6-abhängigen Transport dieser Sekundärmetaboliten hindeutet.
Die genauen Mechanismen, welche die Akkumulation und Immobilisierung von Mitochondrien, sowie die PEN2-Aggregatbildung regulieren und koordinieren sind unbekannt. Um neue Erkenntnisse in diesem Bereich der präsinvasiven Resistenz zu bekommen wurden Immunoprezipitationsanalysen und anschließende massenspektrometrische Analysen durchgeführt. Diese Analysen identifizierten das Guanylate-binding family protein-like 3 (GBPL3) als einen potentiellen Interaktionspartner von PEN2. Guanylat-bindende Proteine sind in Säugetieren an der Zell-autonomen Resistenz gegen eine Vielzahl von intrazellulären Pathogenen beteiligt (Kim et al., 2012; Tretina et al., 2019). In dieser Arbeit wurden gbpl3 Mutaten untersucht, es konnten jedoch keine homozygoten Pflanzen isoliert werden. Dies deutet daraf hin, dass GBPL3 eine essentielle Funktion in der Embryo- und Samenentwicklung hat. Herozygote gbpl3 mutanten zeigten eine mit dem Wildtyp verleichbare Bgh-Invasionsrate. | de |
| dc.description.abstracteng | The Arabidopsis thaliana cytochrome P450 monooxygenase CYP81F2 and the myrosinase PENE-TRATION2 (PEN2) are important components for broad-spectrum pre-invasion defense against filamentous plant pathogens, including non-adapted powdery mildews (Lipka et al., 2005; Bednarek et al., 2009; Clay et al., 2009; Fuchs et al., 2016). PEN2 is a tail-anchored protein, which is targeted to both peroxisomes and mitochondria. Pathogen-triggered recruitment and accumulation of mitochondrial subpopulations were observed at sites of attempted fungal penetration. Moreover, mitochondrial immobilization is accompanied by aggregate formation of PEN2 on the outer mitochondrial membrane on clustered and immobilized mitochondria (Fuchs et al., 2016). PEN2 was shown to form pathogen-triggered oligomers and dimers of higher order in the periphery of arrested mitochondria (Fuchs et al., 2016). The ER-localized CYP81F2 accumulates in infected cells. Upon pathogen attack, the ER reorganizes in proximity to the arrested mitochondria (Fuchs et al., 2016). CYP81F2 functions in the pathogen-induced biosynthesis of 4MI3G (4-methoxyindol-3-ylmethyl glucosinolate), which is a substrate of the PEN2 myrosinase. PEN2 catalyzes the hydrolyzation of 4MI3G, resulting in the formation of toxic hydrolysis products (Bednarek et al., 2009; Clay et al., 2009). The ABC transporter PENETRATION3 (PEN3) is proposed to secrete these biologically active indole glucosinolates (IG)-metabolism products across the plasma membrane and into the apoplast to terminate attempted pathogen entry at the cell periphery (Stein et al., 2006; Matern et al., 2019).
These pathogen-induced and cell-autonomous defense mechanisms at the site of attempted fungal invasion very likely require sensing of the potential intruder by the plant. To study the connection between pathogen recognition and PEN2-mediated defense, the first part of the presented study focused on the role of microbe-associated molecular pattern (MAMP)-dependent signaling for CYP81F2 accumulation, ER rearrangement, mitochondrial arrest and PEN2 aggregate formation. CYP81F2-RFP accumulated in the ER and nuclear envelope after flagellin and chitin infiltration. Moreover, mitochondrial arrest and PEN2-aggregate formation was induced upon the perception of MAMPs, similar to powdery mildew infection. Additionally, MAMP-induced PEN2-GFP-TAPEN2 aggregates with increased fluorescence on single, mobile mito-chondria.
The second part of this project focused on the identification and characterization of novel molecular components contributing to PEN2-mediated pathogen entry control. For this purpose, a homozygous double transgenic line expressing both PEN2-GFP-TAPEN2 and CYP81F2-mKate2 from a single cassette was generated and characterized. The T-DNA insertion disrupts no coding sequence. CLSM of GFP-tagged PEN2 and mKate2-tagged CYP81F2 showed expected localization and accumulation patterns unchallenged and 20 hpi with Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh). The selected line might be used for a CLSM-based forward genetic screen to identify novel molecular components required for CYP81F2/PEN2-mediated disease resistance.
The Glutathione-S-transferase class-tau member 13 (GSTU13) is an important molecular component of the PEN2 defense pathway for IG metabolism. It is suggested that GSTU13 mediates the conjugation of the unstable I3G-ITC (indol-3-ylmethyl-isothiocyanate)/4MI3G-ITC (4-methoxyindol-3-ylmethyl-isothiocyanate) with glutathione. GSTU13 was shown to be required for the formation of the end products indol-3-ylmethyl amine (I3A), raphanusamic acid (RA) and 4-O-β-d-glucosyl-indol-3-yl formamide (4OGlcI3F) of the PEN2 pathway (Piślewska-Bednarek et al., 2018). This study showed that N- and C-terminally RFP-tagged GSTU13 is localized to the cytosol, the nucleus and punctate structures, which showed no co-localization with PEN2. Upon powdery mildew attack, the cytoplasm relocalized to the site of attempted Bgh invasion, which was accompanied by elevated GSTU13-RFP fluorescence intensities.
Several molecular components involved in pre-invasive non-host resistance were previously shown to be co-regulated with PEN2 and PEN3 in Arabidopsis (Humphry et al., 2010). To identify additional compounds required for PEN2-mediated resistance, two co-expressed genes, AT1G08930 (Early response to dehydration 6 (ERD6)) and AT1G55450 (S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase; named SAM-MT) were selected for further analysis in this study.
ERD6 was shown to be required for penetration resistance against Erysiphe pisi at 72 hpi but does not contribute to defense against Bgh and Golovinomyces orontii. It was demonstrated that the transporter localizes to multivesicular bodies/late endosomes (MVBs/LEs) and the lumen of the vacuole in unchallenged leaf epidermal cells. Upon infection, ERD6 positive vesicles were shown to accumulate at powdery mildew contact sites and in proximity to clustered and immobilized mitochondria decorated with aggregates of PEN2. An untargeted metabolomic approach revealed that the PEN2/CYP81F2 substrate I3G, the IGMT1 and IGMT2 substrate 4OHI3G, the PEN2 substrate 4MI3G and glycosylated dihydroascorbigen accumulated in erd6 mutants, suggesting that ERD6 might be required for the transport of these substances.
The regulatory pathways that coordinate the accumulation and immobilization of mitochondrial subpopulations and PEN2-aggregate formation are unknown. To gain new insights into the molecular mechanisms of PEN2-mediated pathogen entry control, IP-MS experiments were performed to identify potential PEN2 interactors. This analysis identified the Guanylate-binding family protein-like 3 (GBPL3) as a potential PEN2 interaction partner. Guanylate binding proteins function in cell-autonomous immunity against a broad spectrum of intracellular pathogens in mammals (Kim et al., 2012; Tretina et al., 2019). In this study, no homozygous gbpl3 mutants were found, suggesting embryo-lethality and a potential defect in seed development. Heterozygous gbpl3 mutants showed wild-type-like Bgh invasion frequencies. | de |
| dc.contributor.coReferee | Feußner, Ivo Prof. Dr. | |
| dc.subject.ger | PEN2 | de |
| dc.subject.eng | PEN2 | de |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-21.11130/00-1735-0000-0008-58D0-A-5 | |
| dc.affiliation.institute | Biologische Fakultät für Biologie und Psychologie | de |
| dc.subject.gokfull | Biologie (PPN619462639) | de |
| dc.description.embargoed | 2022-07-13 | |
| dc.identifier.ppn | 1765837723 | |