Über die Differenzierung und Charakterisierung von Kardiomyozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen aus Rhesusmakaken in 2D- und 3D-Kulturen
About the differentiation and characterization of cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells from rhesus macaques in 2D- and 3D-cultures
by Arne Benjamin Krahn
Date of Examination:2021-11-16
Date of issue:2021-11-03
Advisor:Prof. Dr. Wolfram-Hubertus Zimmermann
Referee:Prof. Dr. Wolfram-Hubertus Zimmermann
Referee:PD Dr. Katrin Streckfuß-Bömeke
Referee:Prof. Dr. Ralf Dressel
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8924
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Abstract
English
Introduction: Cardiovascular diseases play a leading role in the western industrial nations in terms of mortality, morbidity and economic costs. At the same time, the heart transplant is the only causal therapy for heart failure. In the context of this work, the already established model of the engineered heart muscle (EHM) was used and adapted to generate an allograft in a large animal model (rhesus macaque). For this purpose, appropriate differentiation protocols to produce heart muscle cells from induced pluripotent stem cells of the rhesus macaque (riPSC) were developed. Methods: Cardiomyocytes were obtained from riPSC by directed differentiation - via biphasic pharmacological modulation of the Wnt signaling pathway -, purified by metabolic selection and analyzed regarding their morphological and functional characteristics. In a second step, these cardiomyocytes were used to produce EHM by mixing with collagen type I hydrogel according to a protocol that had already been established for heart muscle cells of other origins (Zimmermann et al. 2000). Their functional and morphological properties were examined by means of contraction force measurements under pharmacological stimulation, action potential analyzes and immunofluorescence staining. Results: The cardiomyocytes obtained by differentiation showed spontaneous contractions and immunofluorescence staining showed typical proteins of cardiac sarcomeres and their characteristic anisotropic arrangement. An electrical coupling could be verified by synchronized calcium transients. The EHM generated in this work showed a positive inotropic reaction when the extracellular calcium concentration was increased. However, they did not show a statistically significant positive inotropic response to beta-adrenergic stimulation with isoprenaline. Typical cardiac action potentials could be demonstrated by means of action potential analyzes. In addition, the EHM showed strong muscle bundles aligned along their longitudinal axis with characteristic anisotropic arrangement and further maturation of the sarcomeres. Discussion: The cardiac differentiation of hiPSC has already been shown many times (Paige et al. 2010; Lian et al. 2012; Streckfuss-Bömeke et al. 2013; Kadari et al. 2015), whereas stem cells from non-human primates have received little attention so far (Leschik et al. 2008; Blin et al. 2010; Wunderlich et al. 2012; Zhao et al. 2018). The present work was able to show that riPSC differentiate into cardiomyocytes and can be used in the production of functional EHM. The EHM produced here fulfilled three of four criteria that Soong et al. (2012) set up for "high quality human EHM": They showed visible, spontaneous contractions with a frequency of over 60 beats per minute and generated an isometric force of over 0.2 mN at a calcium concentration of 2 mmol / l. In doing so, however, they remained below the level of strength of other work. They also included organized muscle bundles made up of anisotropically organized sarcomeres. However, they did not show a positive inotropic reaction to the stimulation with isoprenaline and therefore did not meet this criterion.
Keywords: Engineered heart muscle; Rhesus macaque; Tissue engineering; EHM; Cardiac differentiation; riPSC; Immunofluorescence; Flow cytometry
German
Einleitung: Herzkreislauf-Erkrankungen nehmen in den westlichen Industrieländern bezüglich Mortalität, Morbidität und volkswirtschaftlichen Kosten eine führende Rolle ein. Gleichzeitig ist die Herztransplantation die einzige kausale Therapie der Herzmuskelschwäche. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das bereits etablierte Modell des engineered heart muscle (EHM) verwendet und für die Anwendung als Allotransplantat in einem Großtiermodell (Rhesusaffe) angepasst. Dazu mussten Differenzierungsprotokolle zur Herstellung von Herzmuskelzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen des Rhesusaffen (riPSC) entwickelt werden. Methoden: Kardiomyozyten wurden durch gerichtete Differenzierung – über biphasische pharmakologische Modulation des Wnt-Signalweges – aus riPSC gewonnen, durch metabolische Selektion aufgereinigt und bezüglich ihrer morphologischen und funktionellen Charakteristika analysiert. In einem zweiten Schritt wurden diese Kardiomyozyten genutzt, um nach einem bereits für Herzmuskelzellen anderer Abstammung etablierten Protokoll EHM durch Vermischung mit Kollagen Typ I Hydrogel herzustellen (Zimmermann et al. 2000). Deren funktionelle und morphologische Eigenschaften wurden durch Kontraktionskraftmessungen unter pharmakologischer Stimulation, Aktionspotentialanalysen und Immunfluoreszenzfärbungen untersucht. Ergebnisse: Die durch Differenzierung gewonnenen Kardiomyozyten zeigten spontane Kontraktionen und über Immunfluoreszenzfärbungen konnten typische Proteine kardialer Sarkomere und deren charakteristische anisotrope Anordnung nachgewiesen werden. Eine elektrische Kopplung konnte durch synchronisierte Kalzium-Transienten verifiziert werden. Die in dieser Arbeit generierten EHM zeigten eine positiv inotrope Reaktion bei einer Erhöhung der extrazellulären Kalziumkonzentration. Jedoch zeigten sie keine statistisch signifikante positiv inotrope Reaktion auf beta-adrenerge Stimulation mit Isoprenalin. Mittels Aktionspotentialanalysen konnten typisch kardiale Aktionspotentiale nachgewiesen. Zudem zeigten sich in den EHM kräftige, entlang ihrer Längsachse ausgerichtete Muskelbündel mit charakteristischer Querstreifung und einer weiteren Ausreifung der Sarkomere. Diskussion: Die kardiale Differenzierung von hiPSC konnte bereits vielfach gezeigt werden (Paige et al. 2010; Lian et al. 2012; Streckfuss-Bömeke et al. 2013; Kadari et al. 2015), wohingegen Stammzellen nicht-humaner Primaten bisher wenig Beachtung auf diesem Feld fanden (Leschik et al. 2008; Blin et al. 2010; Wunderlich et al. 2012; Zhao et al. 2018). Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass riPSC zu Kardiomyozyten differenziert und in der Herstellung von funktionellen EHM verwendet werden können. Die hier produzierten EHM erfüllten drei von vier Kriterien, die Soong et al. (2012) für „humane EHM hoher Qualität“ aufstellten: Sie zeigten sichtbare, spontane Kontraktionen mit einer Frequenz von über 60 Schlägen pro Minute und erzeugten eine isometrische Kraft von über 0,2 mN bei einer Kalziumkonzentration von 2 mmol/l. Dabei blieben sie allerdings unter dem Kraftniveau anderer Arbeiten. Zudem beinhalteten sie organisierte Muskelbündel aus anisotrop organisierten Sarkomeren. Sie zeigten allerdings keine positiv inotrope Reaktion auf die Stimulation mit Isoprenalin und erfüllten dieses Kriterium somit nicht.
Schlagwörter: Herzmuskel; Immunfluoreszenzfärbung; EHM; riPSC; tissue engineering; Herzmuskelgewebe; Rhesusaffe; Durchflusszytometrie; engineered heart muscle
