Untersuchungen zu Amyloid-β-Peptiden im humanen Blutplasma als Biomarkerkandidaten der Alzheimerkrankheit

Rohdenburg, Lara

dc.contributor.advisor	Wiltfang, Jens Prof. Dr.
dc.contributor.author	Rohdenburg, Lara
dc.date.accessioned	2022-01-14T10:25:15Z
dc.date.available	2022-02-02T00:50:08Z
dc.date.issued	2022-01-14
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/21.11130/00-1735-0000-0008-59EE-9
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9045
dc.language.iso	deu	de
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc	610	de
dc.title	Untersuchungen zu Amyloid-β-Peptiden im humanen Blutplasma als Biomarkerkandidaten der Alzheimerkrankheit	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.title.translated	Analysis of amyloid-β peptides in human blood plasma as biomarker candidates of Alzheimer´s Disease	de
dc.contributor.referee	Wiltfang, Jens Prof. Dr.
dc.date.examination	2022-01-25
dc.description.abstractger	Eine selektiv erniedrigte Aβ1-42-Konzentration und eine geringe Aβ1-42/Aβ1-40-Ratio im Liquor sind gut belegte Biomarker für die Alzheimerkrankheit. Verglichen mit den Messungen im Liquor, wäre eine Messung der Biomarker im Blutplasma von großem Vorteil, da Blut leichter zu entnehmen ist. Allerdings erschweren geringe Konzentrationen und Matrixeffekte im Blut die zuverlässige Messung der Aβ-Peptide und ihrer Ratios. Ziel der Dissertation war es, einen kürzlich entwickelten Blut-basierten Zwei-Schritt-Immunoassay, bestehend aus Immunpräzipitation von Aβ-Peptiden aus EDTA-Blutplasma gefolgt von einem Sandwich-Multiplex-Immunoassay, zu untersuchen und gezielt ausgewählte Validierungsexperimente durchzuführen. Magnetische Beads wurden kovalent an einen monoklonalen Anti-Aβ-Antikörper gebunden, um vor der Immunpräzipitation die Peptide aus dem Blutplasma anzureichern. Im Anschluss erfolgte die Qualitätskontrolle mittels Western-Blot-Analysen. In dem Zwei-Schritt-Immunoassay wurden die Aβ-Peptide zuerst mittels Immunpräzipitation aus dem Blutplasma angereichert. Im Anschluss wurden Aβ38, Aβ40 und Aβ42 gleichzeitig mit einem kommerziell erhältlichen Multiplex-Immunoassay mit Chemolumineszenzreadout quantifiziert. Im Rahmen der „Fit-for-purpose“-Assay-Validierung wurden der Einfluss von Einfrier- und Auftauvorgängen vor dem Immunoassay, Intra- und Interassay-Varianz, Limits of Detection und Limits of Quantification, Parallelism, Assayselektivität, Spike-Wiederfindungsraten, die Effizienz der Immunpräzipitation, verschiedene Plasmavolumina und mögliche Positionseffekte untersucht. Abschließend wurde mit dem Zwei-Schritt-Immunoassay eine klinische Kohorte, bestehend aus 40 Plasmaproben, die nach der bekannten Liquor Aβ42/Aβ40-Ratio dichotomisiert worden waren, untersucht. Das Einfrieren und Auftauen nach der Immunpräzipitation hatte nur marginale Effekte auf die Aβ-Messungen. Daher konnte eine zeitliche Trennung der vorgeschalteten Aβ-Peptid-Konzentration von der Quantifizierung in die Assay-Durchführung aufgenommen werden. Die Validierungsexperimente zeigten eine hohe Interassay-Varianz. Aus diesem Grund wurde eine Normalisierung mittels einer kleinen Anzahl an Qualitätskontroll-Proben aus jedem Assay-Durchgang zur Korrektur verwendet. Abgesehen davon wiesen die Beobachtungen darauf hin, dass der Assay für den beabsichtigen Zweck angewendet werden kann. Es lag kein signifikanter Unterschied zwischen den zwei Gruppen der kleinen klinischen Kohorte (n = 40) bezüglich der Aβ42/Aβ40-Ratio vor. Im Gegensatz dazu war die Aβ42-Konzentration in der biomarkerpositiven Gruppe signifikant erniedrigt. Die Vorab-Konzentrierung der Aβ-Peptide und die folgende Aβ-Messung können an unterschiedlichen Tagen durchgeführt werden. Dies erleichtet die Aufnahme des Zwei-Schritt-Immunoassay-Protokolls in die gewöhnlichen Laborabläufe. Eine Normalisierung hat sich als nützliches Werkzeug erwiesen, um eine hohe Interassay-Varianz zu korrigieren. In der Zukunft sollte der Zwei-Schritt-Immunoassay weiter verbessert und standardisiert werden. Es ist sehr wichtig, Qualitätskontrollproben in jeden Assay-Durchgang einzuschließen. Weitere Studien mit größeren und klinisch unabhängigen Kohorten müssen mit diesem Assay zukünftig durchgeführt werden, um den diagnostischen Wert der Aβ42/Aβ40-Ratio im Plasma als Biomarker der Alzheimerkrankheit zu bestimmen.	de
dc.description.abstracteng	A selectively reduced concentration of Aβ1-42 and a low A β1-42/1-40 ratio in cerebrospinal fluid (CSF) are well-known biomarkers for Alzheimer´s Disease. Compared to the measurements in CSF, the examination of biomarkers in blood-plasma would be highly advantageous, because blood is more easily accessible. However, low concentrations and potential matrix interferences may hinder the reliable quantification of Aβ-peptides and their ratios in blood plasma. The aim of this thesis was to assess and partially validate the technical performance of a recently developed blood-based two-step Aβ-immunoassay, consisting of immunoprecipitation of Aβ-peptides from EDTA blood plasma followed by quantification on a sandwich-type multiplex immunoassay. Magnetic beads were covalently linked to a monoclonal anti-Aβ antibody for the pre-enrichment of Aβ-peptides from blood plasma by immunoprecipitation, followed by quality control with western blot analysis. In the two-step Aβ-immunoassay, the Aβ-peptides were first pre-concentrated from blood plasma by magnetic bead immunoprecipitation, and thereafter Aβ38, Aβ40 and Aβ42 were quantified simultaneously with a commercially available multiplex immunoassay with chemoluminescencereadout. The “fit-for-purpose” assay validation assessed the impact of freezing and thawing cycles prior to the immunoassay, intra- and interassay variance, limits of detection and quantification, parallelism, assay selectivity, spiking recoveries, the efficiency of the immunoprecipitation , different sample volumes and possible microplate positional effects. Finally, a clinical sample including 40 blood plasma samples that were dichotomized according to the known CSF Aβ 42/40 ratios were examined with the two-step immunoassay. After immunoprecipitation, pre-analytical freezing and thawing had negligible effects on the Aβ measurements. Thus, a temporal separation between Aβ pre-concentration and quantification could be implemented. The assay validation experiments revealed a very high inter-assay variance. For that reason, a normalization based on a small number of quality control samples within each assay run was used for correction. Apart from that, the observations indicated that the assay is suitable for the intended purpose. There was no statistically significant difference between the two groups in the small clinical sample (n = 40) regarding the blood plasma Aβ42/Aβ40 ratio. In contrast, the Aβ42 concentration was significantly decreased in the biomarker positive group. The pre-analytical Aβ-immunoprecipitation and following Aβ measurements can be performed on separate days. This facilitates the implementation of the two-step immunoassay protocol in the ordinary laboratory routine. Normalization between different assay runs turned out to be a useful tool to correct for high inter-assay variance. In the future the two-step-immunoassay should be further improved and standardized. It is highly important to include quality control samples for normalization in each assay run. Further studies including larger and independent clinical samples will be required to assess the diagnostic value of the blood plasma Aβ42/40 ratio determined with this assay as a biomarker for Alzheimer’s disease.	de
dc.contributor.coReferee	Zerr, Inga Prof. Dr.
dc.subject.ger	Alzheimerkrankheit	de
dc.subject.ger	Aβ-Peptide	de
dc.subject.ger	Immunoassay	de
dc.subject.ger	Immunpräzipitation	de
dc.subject.ger	Liquor	de
dc.subject.ger	Plasma	de
dc.subject.ger	Demenz	de
dc.subject.ger	Aβ42/Aβ40-Ratio	de
dc.subject.ger	Assay-Validierung	de
dc.subject.eng	Alzheimer`s Disease	de
dc.subject.eng	Aβ peptides	de
dc.subject.eng	Immunoassay	de
dc.subject.eng	Immunoprecipitation	de
dc.subject.eng	Cerebrospinal fluid	de
dc.subject.eng	CSF	de
dc.subject.eng	Blood plasma	de
dc.subject.eng	Dementia	de
dc.subject.eng	Aβ42/Aβ40 ratio	de
dc.subject.eng	Assay validation	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-21.11130/00-1735-0000-0008-59EE-9-5
dc.affiliation.institute	Medizinische Fakultät	de
dc.subject.gokfull	Medizin (PPN619874732)	de
dc.description.embargoed	2022-02-02
dc.identifier.ppn	1786197065

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Human- und Zahnmedizin [2877]

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