Expansionsmikroskopie des Rattenhirns zur subzellulären Lokalisation synaptischer Proteine
Rat brain expansion microscopy for subcellular localization of synaptic proteins
by Nils Alexander Kemna
Date of Examination:2022-02-14
Date of issue:2022-01-26
Advisor:Prof. Dr. Silvio Rizzoli
Referee:Prof. Dr. Silvio Rizzoli
Referee:Prof. Dr. Stefan Jakobs
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9052
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Abstract
English
The basis and drive for the implementation of the present work was the desire for a more precise understanding of the subcellular distribution and quantity of presynaptic proteins in presynapses of different brain regions. This information provides largely unknown foundations for understanding the organization of neural cycles, the emergence of complex central nervous processes, such as memory formation and the development of neurological diseases. Different subcellular protein organizations could contribute to the formation of varying presynaptic properties. For a long time, presynapses could only be represented by technically complex and cost-intensive high-resolution imaging techniques. The basis for carrying out this work was therefore the method of expansion microscopy published in 2015. It achieves a lateral resolution of 60-70 nm using an epifluorescence microscope, with comparatively little effort. By physically enlarging rat brain sections, the wide-ranging, simultaneous, subcellular investigation of several fluorescence-labelled presynaptic proteins in presynapses of different neuron types of different brain regions was made possible. Using specific MATLAB routines, the fluorescence signals of the testproteins Synaptophysin, Bassoon, SNAP-25, VGLUT 1/2 and Amphiphysin were added up. The average fluorescence images of the examined presynapses from different brain regions of the hippocampus, the somatosensory cortex and the motor cortex were then analyzed comparatively with respect to full width at half maximum and fluorescence peaks of the detected fluorescence signals. The experimental focus was on the test proteins Bassoon (active zone) and synaptophysin (vesicle cluster). The obtained data could be statistically evaluated using the SigmaPlot 10 software and made it possible to draw conclusions regarding the subcellular distribution and relative amount of the test proteins in hippocampal and cortical presynapses from different regions of the rat brain. This form of evaluation of subcellular fluorescence signals of different proteins did not provide information on exact positions and amounts of individual proteins, within the differently localized presynapses, but made it possible to make rough estimates of possible available, generalized subcellular protein organizations. The proteins studied, compared to the brain regions studied, showed only a few significant differences in their subcellular distribution and quantity. Presynapses in different areas of the brain appear to differ slightly in the subcellular organization of the test proteins. This suggested that the subcellular organization of the presynaptic proteome is generally comparable in different localized presynapses. The regulation of protein activities may thus play a more important role in the expression of presynaptic activity than the subcellular distribution and quantity of proteins compared to different presynapses. Furthermore, an interplay of the demonstrably varying post-synaptic proteome with the, according to the results obtained in this work, on average similar presynaptic proteome of different brain regions, appears possible in the course of the formation of varying synaptic activities. In addition, the presented work shows that with the help of expansion microscopy and subsequent evaluation of average fluorescence signals, high-resolution microscopy can be operated with little financial and instrumental effort. The applied methodology allows the simultaneous investigation of several proteins in different brain regions. In the future, expansion microscopy, in combination with other investigation methods such as electron microscopy and mass spectrometry, could enable the creation of average presynapses of a variety of different brain regions at a smaller effort than using alternative, high-resolution microscopy techniques such as STED, thus making a major contribution to mapping the highly complex neuronal interconnection of the brain and researching the molecular organization of synaptic structures.
Keywords: expansion microscopy; rat brain; synaptophysin; bassoon; amphiphysin; snap-25; vglut; synaptic proteins; high resolution microscopy
German
Grundlage und Antrieb zur Durchführung der vorliegenden Arbeit war der Wunsch nach einem präziseren Verständnis bezüglich der subzellulären Verteilung und Menge präsy-naptischer Proteine in Präsynapsen verschiedener Hirnregionen. Diese Informationen stellen bisher weitestgehend unbekannte Grundlagen zum Verständnis der Organisation neuronaler Kreisläufe, der Entstehung komplexer zentralnervöser Vorgänge, wie bei-spielsweise der Gedächtnisbildung und der Entstehung neurologischer Erkrankungen dar. Diesbezüglich wurde vor Beginn der Arbeit die Hypothese aufgestellt, dass unterschied-liche subzelluläre Proteinorganisationen zur Ausbildung variierender präsynaptischer Ei-genschaften beitragen. Präsynapsen konnten lange Zeit nur durch technisch hochkom-plexe und kostenintensive, hochauflösende, bildgebende Verfahren dargestellt werden. Die Grundlage zur Durchführung der vorliegenden Arbeit bildete deswegen das im Jahr 2015 publizierte Verfahren der Expansionsmikroskopie. Sie erzielt, bei vergleichbar ge-ringem Aufwand, eine laterale Auflösung von 60-70 nm unter Anwendung eines Epiflu-oreszenzmikroskops. Durch physische Vergrößerung von Rattenhirnschnitten wurde so die breitgefächerte, gleichzeitige, subzelluläre Untersuchung mehrerer fluoreszenzmar-kierter präsynaptischer Proteine in Präsynapsen unterschiedlicher Neuronentypen ver-schiedener Gehirnregionen ermöglicht. Unter Anwendung spezifischer MATLAB-Rou-tinen wurden die Fluoreszenzsignale der Testproteine Synaptophysin, Bassoon, SNAP-25, VGLUT 1/2 und Amphiphysin summiert. Die so erstellen durchschnittlichen Fluo-reszenzbilder der untersuchten Präsynapsen aus verschiedenen Hirnregionen des Hippo-campus, des somatosensorischen Kortex und des motorischen Kortex wurden anschlie-ßend hinsichtlich Halbwertsbreiten und Signalintensitäten der detektierten Fluoreszenz-signale vergleichend analysiert. Der experimentelle Fokus lag hierbei auf den Testprote-inen Bassoon (aktive Zone) und Synaptophysin (Vesikelcluster). Die erhaltenen Daten konnten unter Anwendung der Software SigmaPlot 10 statistisch ausgewertet werden und ermöglichten es, Rückschlüsse hinsichtlich der subzellulären Verteilung und relativen Menge der Testproteine in hippocampalen und kortikalen Präsynapsen aus verschiedenen Regionen des Rattengehirns zu ziehen. Diese Form der Auswertung subzellulärer Fluoreszenzsignale verschiedener Proteine gab zwar keine Auskünfte über exakte Positionen und Mengen einzelner Proteine, innerhalb der unterschiedlich lokalisierten Präsynapsen, ermöglichte jedoch, grobe Schätzungen hinsichtlich möglicherweise vorliegender, generalisiert voneinander abweichender sub-zellulärer Proteinorganisationen. Die untersuchten Proteine wiesen im Vergleich untersuchten Hirnregionen lediglich vereinzelt signifikante Unterschiede hinsichtlich ih-rer subzellulären Verteilung und Menge auf. Präsynapsen in unterschiedlichen Bereichen des Gehirns unterscheiden sich anscheinend hinsichtlich der subzellulären Organisation der Testproteine geringfügig voneinander. Hieran ließ sich vermuten, dass sich die sub-zelluläre Organisation des präsynaptischen Proteoms unterschiedlich lokalisierter Präsy-napsen generell ähnelt. Der Regulation der Proteinaktivitäten kommt somit möglicher-weise eine bedeutendere Rolle, bei der Ausprägung der präsynaptischen Aktivität zu als der subzellulären Verteilung und Menge der Proteine im Vergleich unterschiedlicher Prä-synapsen. Weiterhin erscheint ein Zusammenspiel des nachweisbar variierenden postsy-naptischen Proteoms mit dem, gemäß der in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse, durch-schnittlich ähnlichem präsynaptischen Proteom verschiedener Hirnregionen, im Zuge der Ausbildung variierender synaptischer Aktivitäten möglich. Ergänzend zeigt die vorge-legte Arbeit, dass mit Hilfe der Expansionsmikroskopie und anschließender Auswertung summierter, durchschnittlicher Fluoreszenzsignale, hochauflösende Mikroskopie mit ge-ringem finanziellen und instrumentellen Aufwand betrieben werden kann. Die ange-wandte Methodik ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Proteine in ver-schieden Hirnregionen. Die Expansionsmikroskopie könnte zukünftig, in Kombination mit weiteren Untersuchungsverfahren wie beispielsweise der Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie die Erstellung durchschnittlicher Präsynapsen einer Vielzahl ver-schiedener Hirnregionen bei kleinerem Aufwand als unter Anwendung alternativer, hoch-auflösender Mikroskopieverfahren wie beispielsweise STED ermöglichen und so einen großen Beitrag zur Kartierung der hochkomplexen neuronalen Verschaltung des Gehirns und der Erforschung der molekularen Organisation synaptischer Strukturen leisten.
Schlagwörter: Expansionsmikroskopie; Rattengehirn; synaptische Proteine; Synaptophysin; Amphiphysin; Snap-25; VGlut; Bassoon; Hochauflösende Mikroskopie
