Differentielle Genexpressionsanalyse aktivierter Endothelzellen
Differential genexpression-analysis of activated endothelial cells
von Tobias Schmidt
Datum der mündl. Prüfung:2001-04-30
Erschienen:2001-08-28
Betreuer:PD Dr. Hellmut G. Augustin
Gutachter:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
Gutachter:Prof. Dr. Hans-Dieter Söling
Gutachter:Prof. Dr. Dietrich Gradmann
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Name:schmidt.pdf
Size:3.34Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Differential Display-PCR (DD) is a mRNA-fingerprint technique to identify differentially expressed genes by comparing displayed sets of randomized amplified cDNA. For this, an elaborated protocol was established to explore the gene expression of activated endothelial cells as an in vitro model of angiogenesis, the sprouting of blood vessels from already existing ones. More concretely, a two dimensional in vitro model of bovine aortic endothelial cells (BAEC) was employed comparing two activated (subconfluent) cell populations with and without cytokin stimulation (bFGF, fibroblast growth factor 2) to two arrested (confluent) populations with and without an bFGF-inhibitor.107 regulated and reproduced bands derived from 90 DD-primer combinations were chosen for reamplification, leading to 86 cloned gene fragments in-between 300-1200 bp of length. For 47 fragments (55%) the regulation could be verified by northern-blot, which is a overaverage result for DD. By database search it was figured out that the 41 upregulated gene fragments derived from 35 unique genes, consisting of 16 new and 19 known genes containing Proteasom, Endothelin 1, Thrombospondin 1, Caveolin 1, Lipocortin 1, alpha-Gi and several heat-shock proteins. Expression profiling in 8 organ tissues and 3 stages of the ovary cyclus was carried out by northern-blot for each of the 16 new genes. The complete sequence of 5 new genes could be discovered by integration of overlapping ESTs (expressed sequence tags) which were cloned and submitted to EMBL-database. They were characterized as one membran-localized protein (40-9-1) and 4 soluble candidates. Two of them have putative functions in metabolism (40-9-1, 42-9-9), 40-6-3 acts as a cellcyclus-regulator, and 40-2-3 features a partial homolgy to a transcriptional coactivator. Probably most interesting in the angiogensis context are the 10-transmembrane transporter protein-homolog (40-9-1), the regulative elements (40-2-3, 40-6-3), and the remaining candidate (67-11-3) without any known function. For further investigation strategies were prepared.This thesis addresses the pros and cons of DD in general, discussing them comprehensively in the context of current approaches in expression-profiling, discovering their two main limitations: First, the most identificated candidates still are uncharacterized and second, the incompleteness and inaccuracy of databases leads to the selection of candidates for further investigation by pragmatic instead of biological criteria. Nevertheless, there is an extraordinary potential of the new genome-wide expression analysis at the dawn of the genomic era beginning with the complete discovery of the human genome.
Keywords: Differential Display; endothelial cell; EC; HUVEC; BAEC; angiogenesis; gene regulation; expression analysis; northern-blot; expression cloning
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Differential Display-PCR (DD) ist eine komparative mRNA-Fingerprinttechnik zur Identifikation differentiell exprimierter Gene durch die vergleichende Darstellung randomisiert amplifizierter cDNA-Teilpopulationen. Ein optimiert elaboriertes Protokoll dieses Verfahrens wurde eingesetzt zur genetischen Expressionsanalyse aktivierter Endothelzellen als in vitro-Modell für die Biologie der Angiogenese, der Sprossung von Blutgefässen aus bereits bestehenden. Dabei kam ein zweidimensionales in vitro-Modell boviner Aortenendothelzellen (BAEC) zum Einsatz, bei dem zwei aktivierte, subkonfluent proliferierende Zellpopulationen ohne und mit Zytokinstimulation (bFGF, Fibroblasten-Wachstumsfaktor II) gegenüber zwei konfluent arretierten Populationen ohne und mit Inhibitor (funktionsneutralisierender Antikörper) desgleichen Zytokins verglichen wurden.Von den bearbeiteten 107 reproduzierten regulierten Banden aus 90 DD-Primerkombinationen liessen sich 86 Genfragmente zwischen 300-1200 bp reamplifizieren und klonieren. Davon konnte für 47 Fragmente (55%) die Regulation im Northern-blot verifiziert werden, eine methodenspezifisch überdurchschnittliche Positivrate. Die bearbeiteten 41 hochregulierten Fragmente liessen sich im Sequenzdatenbankabgleich auf 35 distinkte Gene zurückführen, 16 neue und 19 bekannte Gene, darunter das Proteasom, Endothelin 1, Thrombospondin 1, Caveolin 1, Lipocortin 1, alpha-Gi sowie verschiedene Hitzeschockproteine. Für sämtliche neuen Gene wurden die Expressionsmuster in 8 verschiedenen Organgeweben und dem physiologischen Angiogenesemodell des weiblichen ovariellen Zyklus im Northern-blot bestimmt. Fünf ausgewählte neue Gene konnten mittels EST-Datenbank (expressed sequencetags) durch überlappende Integration vollständig identifiziert und kloniert werden und in der EMBL-Datenbank deponiert. Deren eingehendere Charakterisierung erbrachte einen membranständigen (40-9-1) und 4 lösliche Proteinkandidaten, darunter zwei mit metabolischem Bezug (40-9-1, 42-9-9), ein Zellzyklusregulator (40-6-3) sowie einer mit partieller Homologie zu einem Transkriptions-coaktivator (40-2-3). Von besonderem Interesse im angiogenen Kontext sind davon das 10-transmembranöse Transporterprotein-homolog (40-9-1) und die regulativen Elemente (40-2-3, 40-6-3), sowie der verbleibende Kandidat (67-11-3) ohne näher bestimmte Funktion, für deren weitere Analyse strategische Ansätze erstellt wurden.Die Arbeit adressiert die generellen Vor- und Nachteile von DD und diskutiert sie ausführlich im Spiegel aktueller Ansätze des Expressions-profilings. Dabei werden die beiden gegenwärtigen Limitationen von Expressionsanalysen herausgearbeitet, nämlich die überwiegend noch ausstehende Bearbeitung der meisten identifizierten Kandidaten sowie die Unvollständigkeit und Ungenauigkeit gegenwärtiger Datenbanken mündend in die Auswahl bearbeiteter Kandidaten nach pragmatischen anstelle biologischer Kriterien. Demgegenüber steht das beachtliche Potential der neuen genomweiten Expressionsanalysen in der angehenden genomischen Ära nach der vollständigen Sequenzierung des humanen Genoms.
Schlagwörter: Differential Display; Endothelzellen; EC; HUVEC; BAEC; Angiogenese; Genregulation; Expressionsanalyse; Northern-blot; Expressionsklonierung