Untersuchungen zur Inaktivierung und Reaktivierung der Coenzym B12-abhaengigen Glycerin-Dehydratasen aus Citrobacter freundii und Clostridium pasteurianum
Studies on the inactivation and reactivation of the coenzyme B12-dependent glycerol dehydratases of Citrobacter freundii and Clostridium pasteurianum
von Corinna Seifert
Datum der mündl. Prüfung:2001-05-03
Erschienen:2002-01-11
Betreuer:PD Dr. Rolf Daniel
Gutachter:Prof. Dr. Gerhard Gottschalk
Gutachter:Prof. Dr. Botho Bowien
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Name:seifert.pdf
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
The coenzyme B12-dependent glycerol dehydratase of Citrobacter freundii is subject to suicide inactivation by the natural substrate glycerol during catalysis. We identified dhaF and dhaG as the genes responsible for reactivation of inactivated dehydratase. Northern blot anal! yses revealed that these genes were expressed during glycerol fermentation. The dhaF gene is transcribed together with the three structural genes coding for glycerol dehydratase (dhaBCE), whereas dhaG is coexpressed with the dhaT gene encoding 1,3-propanediol dehydrogenase. The dhaF and dhaG gene products were copurified to homogeneity from cell-free extracts of a recombinant E. coli strain producing both His6-tagged proteins. Both proteins formed a tight complex with an apparent molecular mass of 150 000 Da. The subunit structure of the native complex is probably alpha2beta2. The factor rapidly reactivated glycerol- or O2-inactivated hologlycerol dehydratase and activated the enzyme-cyanocobalamin complex in the presence of coenzyme B12, ATP, and Mg2+. The DhaF-DhaG complex and DhaF exhibited ATP-hydrolyzing activity, which was not directly linked to the reactivation of dehydratase. The purified DhaF-DhaG complex of C. freundii efficiently cross-activated the enzyme-cyanocoba! lamin complex and the glycerol-inactivated glycerol dehydratase of Klebsiella pneumoniae. It was not effective to the glycerol dehydratase of Clostridium pasteurianum and to diol dehydratases of enteric bacteria.
Keywords: Citrobacter freundii; glycerol dehydratase; inactivation; reactivation; coenzyme B12
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Die Coenzym B12 abhaengige Glycerin-Dehydratase aus Citrobacter freundii ist an der anaeroben Umsetzung von Glycerin involviert. Sie katalysiert die Dehydratisierung von Glycerin zu beta-Hydroxypropionaldehyd. Das Enzym unterliegt einer sogenannten ''Suicide''-Inaktivierung durch eben dieses S! ubstrat. Im Verlauf dieser Arbeit wurden dhaF und dhaG als Gene fuer einen Reaktivierungsfaktor der inaktivierten Glycerin-Dehydratase identifiziert. Northern Blot Analysen zeigten, dass die beiden Gene nur waehrend der Glycerinfermentation exprimiert werden. Das dhaF-Gen bildet zusammen mit den drei Strukturgenen der Glycerin-Dehydratase (dhaBCE) ein Operon. Das dhaG-Gen wird zusammen mit dem dhaT-Gen, welches fuer ein weiteres Schluesselenzym der Glycerinfermentation, die 1,3-Propandiol-Dehydrogenase, kodiert, transkribiert. Die His6-getaggten dhaF- und dhaG-Genprodukte wurden aus einem zellfreien Extrakt eines rekombinanten E. coli-Stammes bis zur Homogenitaet gereinigt. Beide Proteine bilden einen Komplex mit einer apparenten Molekularmasse von 150 kDa. Die Untereinheitenstruktur des nativen Komplexes ist alpha2beta2. Der Faktor ist in der Lage, die durch Glycerin oder O2 inaktivierte Glycerin-Dehydratase zu reaktivieren. Ebenso wird der inaktive Cyno-B12-Glycerin-Dehydra! tase-Komplex durch den Faktor reaktiviert. Alle Reaktivierungsreaktionen sind strikt abhaengig von der Zugabe von Coenzym B12, ATP und Mg2+. Sowohl der DhaFG-Komplex als auch DhaF allein besitzen eine ATP-hydrolysierende Aktivität, die jedoch nicht direkt mit der Reaktivierung der Dehydratase gekoppelt ist. Der gereinigte Komplex aus DhaFG aus C. freundii ist desweiteren in Lage , die durch Glycerin bzw Cyano-B12 inaktivierte Glycerin-Dehydratase aus Klebsiella pneumoniae zu reaktivieren. Dagegen zeigte der Komplex aus C. freundii keine Aktivitaet mit der Glycerin-Dehydratase aus Clostridium pasteurianum und Diol-Dehydratasen aus verschiedenen Enterobakterien.
Schlagwörter: Citrobacter freundii; Glycerin-Dehydratase; Inaktivierung; Reaktivierung; Coenzym B12