Fast STED Microscopy
Schnelle STED-Mikroskopie
von Marcel Lauterbach
Datum der mündl. Prüfung:2009-12-15
Erschienen:2010-02-12
Betreuer:Prof. Dr. Tim Salditt
Gutachter:Prof. Dr. Stefan Hell
Dateien
Name:lauterbach.pdf
Size:5.87Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
The spatial resolution of optical far-field microscopes was hampered by diffraction until STED microscopy broke the diffraction limit. This thesis for the first time combines the high spatial resolution of STED microscopy with high temporal resolution to Fast STED microscopy. It heralds the study of fast dynamic processes via STED microscopy: diffraction unlimited movies with 200 images per second are recorded from colloids; video-rate imaging is achieved in living cells. In particular, the diffusion of 36 nm particles is shown at 80 frames per second (fps); the processes at the growth front of a colloidal crystal of particles as small as 200 nm are visualized at 200 fps. Biological samples are imaged and analyzed beyond the proof of principle, driven by open questions from actual biological research: it is shown that the movement of neurotransmitter vesicles encompasses low and high mobility states. The use of pulsed and continuous wave lasers is compared for Fast STED microscopy of living neurons. Customized solutions for the quantitative analysis of the movies, especially for the localization and tracking of neurotransmitter vesicles, are developed and tested in Monte Carlo simulations. The algorithms are extended to show the correlation of the metabolic rate of cells with the density of the Translocase of the Outer Membrane in mitochondria. Beam-scanning STED microscopy is extended to two-color imaging and protein interactions in human stem cells are therewith analyzed, which introduces high-resolution imaging into medical research. The co-localization of the proteins CD63, TIMP-1 and .Beta1-Integrin is shown. The thesis also presents the historic evolution of the knowledge about the diffraction limit and discusses the influence of noise and pixilation on resolution.
Keywords: Fast STED Microscopy; beam-scanning; beamscanning; neurotransmitter vesicles; neurotransmittervesicles; colloids; colloidal crystals; monolayer; in vivo STED microscopy; two-color STED microscopy; TIMP-1; CD63; Integrin; mitochondria; TOM; protein distribution; history of diffraction; Abbe; resolution
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Die räumliche Auflösung optischer Fernfeldmikroskope war durch Beugung begrenzt, bis STED-Mikroskopie das Beugungslimit durchbrach. Diese Doktorarbeit kombiniert zum ersten Mal die hohe räumliche Auflösung dieser Technik mit hoher zeitlicher Auflösung zur Schnellen (strahlabtastenden) STED-Mikroskopie. Sie läutet die Untersuchung schneller dynamischer Prozesse durch STED-Mikroskopie ein: Nicht-beugungsbegrenzte Filme mit 200 Bildern pro Sekunde werden von Kolloiden aufgenommen, lebende Zellen werden mit Videorate gefilmt. Insbesondere werden die Diffusion von 36 nm-Kügelchen mit 80 Bildern pro Sekunde und die Prozesse an der Wachstumsfront eines Kolloidkristalls mit 200 Bildern pro Sekunde gezeigt. Biologische Proben werden nicht nur um des Mikroskopieprinzips willen, sondern mit einer aktuellen biologischen Fragestellung gefilmt und analysiert: Es wird demonstriert, daß die Bewegung von Neurotransmittervesikeln Zustände hoher und niedriger Mobilität beinhaltet. Die Verwendung von gepulsten Lasern für die Schnelle STED-Mikroskopie lebender Neuronen wird mit derjenigen von Dauerstrichlasern verglichen. Methoden für die quantitative Analyse der Filme, insbesondere zur Lokalisierung und Verfolgung von Vesikeln, werden entwickelt. Diese Methoden werden erweitert, um die Korrelation der Stoffwechselrate von Zellen mit der Dichte der Translokase der äußeren Membran in Mitochondrien zu zeigen. Die strahlabtastende STED-Mikroskopie wird auf Zweifarbenaufnahmen ausgedehnt. Damit werden Proteininteraktionen in menschlichen Stammzellen untersucht; dies führt die optische hochauflösende Bildgebung auch in die medizinische Forschung ein. Die Kolokalisierung der Proteine CD63, TIMP-1 und .Beta1-Integrin wird nachgewiesen. Diese Doktorarbeit enthält auch einen historischen Abriß der Erkenntnisse zur Beugungsbegrenzung und diskutiert den Einfluß von Rauschen und Pixeln auf die Auflösung.
Schlagwörter: Schnelle STED-Mikroskopie; Strahlabtastung; Neurotransmittervesikel; Vesikel; Kolloide; Kolloidkristalle; Monolage; in vivo STED-Mikroskopie; Zweifarben-STED-Mikroskopie; Mehrfarbige STED-Mikroskopie; TIMP-1; CD-63; Integrin; Mitochondrien; TOM; Proteinverteilung; Geschichte der Beugungsgrenze; Abbe; Auflösung