Biological Matter in Microfluidic Environment - from Single Molecules to Self-Assembly

Abstract

Sowohl das Zellinnere als auch die zellumgebende Matrix sind von Netzwerken aus Faserproteinen durchzogen. Da die Maschenweite dieser Netzwerke im Bereich weniger Mikrometer liegt, ist die Mikrofluidik besonders geeignet, um einerseits das prinzipielle Verhalten von Einzelmoleküen, umgeben von einem Geflecht aus Polymeren, und andererseits das Zusammenspiel und die Organisation der Netzwerkbestandteile zu charakterisieren. In dieser Arbeit stellen wir neuartige Ergebnisse aus biomimetischen Untersuchungen zweier unterschiedlicher Systeme vor: Einzelmolekülexperimente an Aktin, einem der bedeutendsten intrazellulären Proteine, und in situ Beobachtungen der Faserbildung von Kollagen I, dem häufigsten extrazellulären Protein. Wir verwenden mikrofluidische Messzellen, die mit den Methoden der weichen Lithographie aus elastischen Kunststoffen hergestellt werden. Dadurch sind wir in der Lage, Makromoleküle durch räumlich einschränkende Wände und hydrodynamische Flussfelder zu manipulieren. Um das mechanische Verhalten der Biopolymere zu analysieren und zeitlich und räumlich aufgelöste Reaktionen zu beobachten, kann die Mikrofluidik sehr gut mit an die experimentellen Anforderungen angepassten Untersuchungsmethoden wie Fluoreszenzmikroskopie, Polarisationsmikroskopie und Röntgenstreuungssanalyse kombiniert werden.Die Analyse einzelner fluktuierender Aktinfilamente, deren Bewegung durch enge Kanäle beeinträchtigt ist, ermöglicht eine umfassende Beschreibung der mechanischen Systemeigenschaften. Untersuchungen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie zeigen, dass das Verhalten der Biopolymere von ihrer Konturlänge und der Umgebung, also der Form und Abmessungen der Kanäle, abhängt. Der äußere Einfluss wird als ein parabolisches Wandpotential angenommen. So gelingt es, den Wettstreit zwischen der Biegeenergie der Filamente und dem Einfluss der Kanalwände bemerkenswert genau zu beschreiben. Die Ergebnisse der Experimente sind außerdem im Einklang mit Monte-Carlo-Simulationen und mit Skalengesetzen für die Abstoßlänge und für die Segmentverteilung in Kanälen.Die Experimente an Kollagen I bieten tiefe Einblicke in die dynamische Entwicklung der hierarchischen Organisation natürlicher Kollagenfibrillen. Wir verwenden hydrodynamische Fokussierung in Verbindung mit diffusivem Materialtransport um einen stabilen pH-Gradienten in der Mikrofluidikumgebung zu erzeugen. Dadurch sind wir in der Lage, Nichtgleichgewichtsmessungen durchzuführen und verschiedene Stadien des Selbstorganisationsprozesses an verschiedenen Positionen entlang der Reaktionskoordinate zu beobachten. Wir untersuchen das System auf der Mikrometerskala, indem wir den Vorteil nutzen, dass Kollagen doppelbrechend ist. Zusätzlich können wir mit Röntgenstreuungsanalyse die dynamische Entstehung der kritischen Untereinheiten der Kollagenfibrillen auf der Nanometerskala beobachten. Ein detaillierter Vergleich mit Simulationen zeigt, dass die Finite-Elemente-Methode eine gute Beschreibung unserer experimentellen Ergebnisse im Bezug auf Diffusionsphänomene, pH-Verteilung und den Einfluss der Lösungsviskosität auf das Flussprofil liefert.Die hier vorgestellten Experimente bringen das fundamentale Verständnis der untersuchten biologischen Systeme voran und zeigen darüber hinaus das Potential mikrofluidischer Techniken auf, umfassende Bereiche der Lebenswissenschaften weiter zu entwickeln.