Patched-assoziierte Tumoren: Modifikatorgene und Pathogenese
Patched associated tumors: Modifier genes and pathogenesis
von Frauke Nitzki
Datum der mündl. Prüfung:2008-04-28
Erschienen:2008-06-05
Betreuer:Prof. Dr. Heidi Hahn
Gutachter:Prof. Dr. Wolfgang Engel
Gutachter:PD Dr. Wilfried Kramer
Gutachter:Prof. Dr. Ralf Heinrich
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Patched (Ptch), a component of the Hedgehog (Hh)/Ptch signalling cascade, is frequently mutated in basal cell carcinoma (BCC), medulloblastoma (MB) and rhabdomyosarcoma (RMS). Ptchneo67/+ mice, in which exons 6 and 7 are deleted, show genetic background-dependent susceptibility to the development of these tumors. The C57BL/6N (B6) strain is genetically susceptible to MB, whereas the BALB/c (BALB) background predisposes to RMS. The first aim of this work was to map and to identify the respective modifier genes. Within the scope of this work the RMS susceptibility modifier locus Parms1 (Patched-Associated RMS 1) was identified on chromosome 2 between D2Mit37 and D2Mit102. Within this region dominant BALB alleles confer RMS susceptibility. These data were published in Genomics (H Hahn et al., 2004). SNP or gene expression analyses were performed for eleven candidate modifier genes. Due to the enhanced expression of Catenin src in skeletal muscle of B6 mice and due to its tumor suppressing function this gene might be involved in the modulation of RMS susceptibility. In order to refine the location of Parms1, a second genome wide scan was performed on 218 B6x(BALBxB6)Ptchneo67/+ N2 mice using 97 polymorphic microsatellite markers. In addition, the progeny of a cross between B6Ptchneo67/+ mice and either 129Sv, DBA2J or FVB/N inbred mice were screened for tumor formation. DNA of these mice should have been used to further narrow down the RMS susceptibility region on the basis of correlation between segment identity and tumor phenotype. During the study heterozygosity at some loci of the C57BL/6N mouse strain derived from Charles River Laboratories were noticed. A panel of 100 SNP markers was used to confirm and specify the genetic contamination. Retrospective analyses demonstrated that the contamination took place as early as autumn 2003 and has persisted ever since at a fairly constant level. Contaminating alleles most probably originated from a DBA strain (F Nitzki et al., 2007). Due to the contamination the mapping project was cancelled. The second project dealt with the characterization of the conditional Ptchflox/flox mouse line. Upon ubiquitous deletion of Ptch that was achieved by a tamoxifen inducible Cre recombinase, the mice developed hyperproliferative changes of the stomach and the mesenterium, a developmental defect of the common lymphoid progenitors in the bone marrow and BCC (A Uhmann et al., 2007). Subsequent analysis of BCC revealed that these tumors were initiated by biallelic deletion of Ptch and arose independent of the hair cycle from both the basal cells of the epidermis and the outer root sheath of the hair follicle. Surprisingly, BCC regressed after 200 days and showed a more differentiated phenotype accompanied by reduced proliferation. As the Hh/Ptch signalling cascade was active at all BCC stages, regression was not caused by downregulation of the pathway’s activity. Since regressing tumors expressed the differentiation markers Keratin 1 (K1) and Keratin 10 (K10) that were never detected at earlier tumor stages, K1 and K10 are most likely associated with regression of BCC. These data contribute to the better understanding of the pathogenesis of these tumors and might help to establish new therapeutic approaches in the future. Finally, the wildtype cell line Ptchflox/flox and the Ptch deficient cell line Ptch-/- or the cell line B9 were generated from skin of Ptchflox/flox and Ptchflox/floxERT2+/- mice, respectively. In B9 cells, deletion of Ptch can be induced by tamoxifen. Similar to stimulation by Shh, tamoxifen-induced Ptch deletion in these cells leads to the activation of the Hh/Ptch pathway. Compared to Ptchflox/flox cells, Ptch-/- cells display constitutive pathway activity as well as an elevated proliferation rate. In both, B9 and Ptch-/- cells the activated signalling cascade can be inhibited by cyclopamine. These cell lines will be employed to improve the current knowledge about the function of Ptch.
Keywords: Patched; modifier genes; rhabdomyosarcoma; basal cell carcinoma
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Mutationen im Patched-Gen (Ptch), welches
für eine Komponente der Hedgehog (Hh)/Ptch Signalkaskade kodiert,
werden häufig bei Basalzellkarzinomen (BCC), Medulloblastomen (MB)
und Rhabdomyosarkomen (RMS) gefunden. Wie Daten aus dem Ptchneo67/+
Tiermodell zeigen, ist die Tumorinzidenz vom genetischen
Hintergrund abhängig. Der Hintergrund C57BL/6N (B6) prädisponiert
die Tiere zu MB, wohingegen der BALB/c (BALB) Hintergrund zu RMS
prädisponiert. Dies weist auf die Existenz von Modifikatorgenen
hin. Ein Ziel dieser Arbeit war die Kartierung und Identifikation
dieser Gene.
Im Rahmen dieses Projektes wurde an der Charakterisierung des
RMS-Suszeptibilitäts-Lokus Parms1 (Patched-Associated RMS 1)
mitgewirkt. Dieser Lokus liegt auf Chromosom 2 im Intervall
zwischen den Mikrosatellitenmarkern D2Mit37 und D2Mit102. In dieser
Region begünstigen dominante BALB-Allele die Entstehung von RMS.
Diese Daten wurden in der Zeitschrift Genomics publiziert (H Hahn
et al., 2004). In den Mauslinien B6 und BALB wurden für elf
Kandidatengene SNP- oder Genexpressions-Analysen durchgeführt.
Aufgrund der Überexpression von Catenin src im Skelettmuskel von
B6-Mäusen und seiner tumorsuppressorischen Funktion könnte dieses
Gen in die Modulation der RMS-Suszeptibilität involviert sein.
Zusätzlich wurde für Feinkartierungsuntersuchungen des Lokus Parms1
in 218 B6x(BALBxB6)Ptchneo67/+ N2-Mäusen eine genomweite
Kopplungsanalyse mit 97 polymorphen Mikrosatellitenmarkern
durchgeführt. Weiterhin wurden Nachkommen aus Kreuzungen von
B6Ptchneo67/+-Mäusen mit den Inzuchtstämmen 129Sv, DBA2J und FVB/N
generiert und auf die Entwicklung von Tumoren untersucht. In den
F1-Generationen sollte dann auf der Basis der Korrelation von
Segmentidentität und Phänotyp eine weitere Kartierung der
RMS-Suszeptibilität durchgeführt werden. Im Laufe der
Untersuchungen wurde eine genetische Kontamination bei B6-Mäusen,
die im Zeitraum von Herbst 2003 bis Frühjahr 2005 von der Firma
Charles River Laboratories zur Etablierung der entsprechenden
Kreuzungen zugekauft worden waren, festgestellt. Die SNP-Analyse
ließ auf eine Kontamination mit einer DBA-Inzuchtlinie schließen (F
Nitzki et al., 2007). Aufgrund dieser Tatsache wurde das
Kartierungsprojekt abgebrochen.
In einem zweiten Projekt wurde die in unserem Labor generierte
Mauslinie Ptchflox/flox charakterisiert. Mittels einer
Tamoxifen-induzierbaren Cre-Rekombinase wurde in diesem
konditionellen Ptch-knockout-Mausmodell eine Ptch-Mutation
induziert. Neben hyperproliferativen Veränderungen der Magenwand
und des Mesenteriums sowie einem Entwicklungsdefekt der allgemeinen
lymphoiden Vorläuferzellen im Knochenmark konnten in diesen Mäusen
BCC hervorgerufen werden (A Uhmann et al., 2007). Die BCC wurden
durch eine biallelische Deletion von Ptch initiiert und entstehen
wahrscheinlich unabhängig von der Haarzyklusphase aus sowohl
Basalzellen der Epidermis als auch der äußeren Wurzelscheide des
Haarfollikels. Interessanterweise wurden die BCC nach 200 Tagen
regredient, zeigten einen differenzierteren Phänotyp und eine
verminderte Proliferation. Da in jedem BCC Stadium die
Hh/Ptch-Signalkaskade aktiv war, kann die Regression nicht durch
eine Inaktivierung des Signalweges bedingt sein. Von regredienten
Tumorstadien wurden die Differenzierungsmarker Keratin 1 (K1) und
Keratin 10 (K10) exprimiert, wohingegen K1 und K10 in den frühen
Tumorstadien nicht detektiert wurden. Daher steht die Expression
von K1 und K10 vermutlich im direkten Zusammenhang mit der
Regression der BCC. Diese Daten leisten einen wichtigen Beitrag zum
besseren Verständnis der Pathogenese dieser Tumorentität und
könnten in der Zukunft eventuell zur Etablierung neuer
Therapieansätze beisteuern.
Schließlich wurde die Zelllinie B9 aus Ptchflox/floxERT2+/--Mäusen
generiert. In diesen Zellen lässt sich eine Ptch-Mutation durch
Behandlung mit Tamoxifen induzieren. Die resultierende
Ptch-Deletion bewirkt eine Aktivierung der Hh/Ptch Signalkaskade,
was auch durch Inkubation der Zellen mit Shh hervorgerufen werden
kann. Zusätzlich wurden die Ptch-defiziente Zelllinie Ptch-/-, die
eine pathologisch aktivierte Hh/Ptch Signalkaskade aufweist, und
die Wildtyp-Ptch Zelllinie Ptchflox/flox etabliert. Ptch-/- Zellen
zeigen im Vergleich zur Zelllinie Ptchflox/flox eine stark erhöhte
Aktivität der Hh/Ptch Signalkaskade sowie eine erhöhte
Proliferationsrate. Sowohl in B9- als auch Ptch-/--Zellen lässt
sich die physiologisch bzw. pathologisch aktivierte Hh/Ptch
Signalkaskade durch die Zugabe von Cyclopamin inhibieren. Diese
Zelllinien können dazu beitragen, die Funktion von Ptch besser zu
verstehen.
Schlagwörter: Patched; Modifikatorgene; Rhabdomyosarkom; Basalzellkarzinom