Mechanistic Plasticity and Molecular Recognition: The Structural Biology of the MAP Kinase Interacting Kinases 1 and 2, the NAD Synthetase and the Zinc Finger Associated Domain

Abstract

In dieser kummulativen Arbeit wurden vier Proteine strukturell und funktionell untersucht. Die Kernergebnisse umfassen die röntgenkristallographische Analyse der katalytischen Domänen der Mitogen aktivierten Protein Kinase (MAPK) interagierenden Kinasen (Mnk) 1 und 2. Diese Proteine phosphorylieren Komponenten der Translationsmaschinerie in Folge der Aktivierung durch MAPK Kaskaden. Es konnte gezeigt werden, dass die Kristallstrukturen von Mnk1 und Mnk2 trotz ausgeprägter Übereinstimmung der Primärsequenz deutliche topologische Unterschiede in den für die Katalyse essentiellen Strukturelementen aufweisen. Beide Proteine nehmen jedoch eine Konformation an, welche mit einer produktiven Bindung von ATP sowie von Substratproteinen unvereinbar ist. Die Kristallstrukturen von Mnk1, Mnk2 und der Mnk2-Punktmutante Mnk2D228G in Kombination mit Aktivitätsassays ermöglichten es, ein Modell zu entwickeln, welches die funktionelle Dynamik von Mitgliedern der Mnk-Unterfamilie beschreibt. Das Model verdeutlicht, dass die Aktivierung dieser Kinasen durch ausgeprägte strukturelle Umlagerungen des Aktivierungssegments ausgelöst wird. Diese Umlagerungen haben weitreichende Folgen für die Konformation angrenzender Strukturelemente. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die Regulation der Mnks über einen Autoinhibierungsmechanismus erfolgt, der durch das strukturell reorganisierte Aktivierungssegment vermittelt wird. Dieser Mechanismus suggeriert Strategien zur Entwicklung von Protein Kinase Inhibitoren. Weitere Erkenntnisse zur funktionellen Dynamik, welche die Aktivierung eines Enzymes auf struktureller Ebene charakterisiert, wurden durch die Untersuchung der Escherischia coli NAD Synthetase (ecoNADS) gewonnen. Ein Ensemble von fünf Kristallstrukturen der ecoNADS wurde analysiert. Die Ergebnisse verdeutlichen strukturelle Umlagerungen, welche durch Bindung von Substrat- bzw. Produktmolekülen ausgelöst werden. Somit ermöglichen die verschiedenen Strukturen die Definition einer Substrat/Produkt-Bindungsform und einer Katalyseform des Enzyms. Zusätzlich wurde die Zink-Finger assoziierte Domäne (ZAD) untersucht. Die ZAD ist ein insektenspezifisches Sequenzmotif, welches im Genom von Drosophila expandiert ist. Biochemische und röntgenkristallographische Daten belegen, dass die ZAD des Transkriptionsfaktors Grauzone ein neuartiges Zink-koordinierendes Strukturmodul verkörpert. Dieses Strukurmodul ermöglicht die Dimerisierung ZAD-enthaltender Proteine, die durch eine charakterische Abfolge hydrophober Aminosäuren vermittelt wird. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ZAD eine essentielle Rolle in der kooperativen Transkriptionskontrolle innerhalb spezifischer phylogenetischer Gruppen spielt.