Biochemische und mechanistische Charakterisierung von Enzymen der Glycosidhydrolase-Familie 4

Abstract

Die Enzyme der Glycosidhydrolase-Familie 4 (GHF4) sind NAD+-abhängig und besitzen N-terminal gelegen eine hochkonservierte Sequenz Gly-Xxx-Gly-Ser (GXGS). Dieses Motiv hat gewisse Ähnlichkeit mit einem konservierten Sequenzmotiv des Rossmann-Fold, bestehend aus einer alternierenden Abfolge von beta-Strängen und alpha-Helizes, die eine konservierte strukturelle Region für die Bindung eines Cofaktors in Proteinen darstellt. Im aktiven Zentrum besitzen sie zusätzlich ein hochkonserviertes Cystein, welches für die Aktivität essentiell ist. Die Gene für drei alpha-Glukosidasen RPMI00511, RPMI00720 und RPMI01263 aus P. miotherma wurden heterolog in E. coli exprimiert und anschließend die entsprechenden Genprodukte charakterisiert. Ebenso wurde mit dem Gen für die alpha-Galaktosidase MelA aus E. coli K12 verfahren. Diese GHF4-Enzyme benötigen zur vollständigen Aktivierung Mn2+-Ionen, NAD+ und stark reduzierende Bedingungen in Form von DTT oder Mercaptoethanol. Zum Reaktionsmechanismus wurden NMR-, Fluoreszenz- und ESR-spektroskopische Untersuchungen vorgenommen. Frühere Untersuchungen an der alpha-Galaktosidase MelA aus E. coli K12 scheiterten aufgrund ihrer hohen Instabilität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das MelA-Gen aus chromosomaler DNA kloniert und als Fusion mit einem His-Tag produziert. Weiterhin wurde die Aktivität durch Zugabe von Mn2+-Ionen so weit konserviert, dass eine biochemische Charakterisierung vorgenommen werden konnte. NMR-Spektroskopische Untersuchungen zum Substratumsatz belegen, dass die Hydrolyse mit Retention der Konfiguration am anomeren Zentrum verläuft. Zusätzliche Untersuchungen durch ESR-Spektroskopie ergaben, dass das Mn2+-Ion eine stark verzerrte oktaedrische Koordinationssphäre im aktiven Zentrum besitzt. Durch die Kombination von Kristallisationsdaten, ESR- und NMR-spektroskopischen Untersuchungen konnte der vorgeschlagene Mechanismus der GHF4 weiter verfeinert und allgemein dargestellt werden. Weiterhin konnte ein Nebenprodukt der enzymatischen Umsetzung aufgereinigt und anschließend dessen chemische Struktur aufgeklärt werden.