Analyse der in-vivo Funktion der Transkriptionsfaktoren TGA2.1 und TGA2.2 aus Tabak nach Fusion mit einer konstitutiven Aktivierungsdomäne

Abstract

Salicylsäure (SA) ist für die pflanzliche Pathogenantwort eine Signalsubstanz von ent-scheidender Bedeutung. In vielen SA-induzierbaren Promotoren findet sich das cis-Element activating sequence 1 (as-1). An dem Proteinkomplex ASF-1 / SARP, der an as-1 und as-1-ähnliche Elemente bindet, sind die bZIP-Transkriptionsfaktoren TGA2.1 und TGA2.2 beteiligt. Eine SA-abhängige Veränderung der Bindungseigenschaften von TGA2.1 bzw. TGA2.2 ist ein möglicher Regulationsmechanismus der as-1-vermittelten Genexpression.Ziel dieser Arbeit war die zeitlich aufgelöste Untersuchung der in-vivo-Bindungseigenschaften von ASF-1 / SARP in Abhängigkeit von SA. Dazu sollten Fusionsproteine zwischen der konstitutiven Aktivierungsdomäne des viralen Proteins 16 (VP16) aus Herpes simplex und den Transkriptionsfaktoren TGA2.1 bzw. TGA2.2 in transgenen Pflanzen überexprimiert werden. Da diese Aktivierungsdomäne einen möglichen SA-regulierten Transaktivierungsschritt ersetzt, können durch die Analyse der Expression von Zielgenen Rückschlüsse auf eine konstitutive oder SA-induzierte Bindung von ASF-1 / SARP gezogen werden. Ferner sollte durch Inhibitorstudien in Tabaksuspensionskulturen die phosphorylierungsabhängige Bindung von ASF-1 / SARP untersucht werden.Es konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von TGA-Fusionsproteinen mit der VP16-Domäne eine SA-induzierte Steigerung der Expression der Zielgene as-1-GUS und Nt103 zur Folge hat. Demzufolge lässt sich auf eine SA-induzierte Bindung von TGA2.1 und TGA2.2 an das as-1-Element schließen. In Gegenwart des Proteinsynthese-Inhibitors Cycloheximid (CHX), der in-vitro zur schnellen Verstärkung der Bindeaffinität von ASF-1 / SARP an as-1 führt, vermittelten die Fusionsproteine nicht die Aktivierung der Zielgene, was impliziert, dass die alleinige CHX-Behandlung in-vivo nicht die schnelle Bindung von ASF-1 / SARP zur Folge hat. Dies steht im Widerspruch zu dem 1996 von JUPIN und CHUA aus in-vitro-Daten abgeleiteten Modell, nach dem die Behandlung mit SA oder CHX zur Dissoziation eines SARP/Inhibitorkomplexes führt, was unmittelbar die Bindung an das as-1-Element nach sich zieht. Aufgrund der hier gewonnenen Daten wird ein zweiter, SA-spezifischer Aktivierungsschritt der Bindung postuliert, der in-vitro bislang nicht gezeigt werden konnte.In Untersuchungen der SA-induzierten Signaltransduktion in Zellkulturen zeigten sich grundsätzliche Unterschiede zur Situation in Blättern. Die SA-induzierte Expression der Zielgene Nt103 und parA war anders als im Blatt bei Überexpression von TGA2.1 dN29 nicht erhöht sondern erniedrigt. Auch die Bindung an das as-1-Element war nach SA-Behandlung in Extrakten aus Wildtyp-Zellkulturen nicht wie im Blatt verstärkt sondern verringert.