Biochemische und zellbiologische Charakterisierung des COP Vesikel vermittelten Proteintransports in Pflanzen

Abstract

Während in Hefen und in Säugetieren die Beteiligung der "coatprotein-coated vesicles" (COP Vesikel) an dem intrazellulären Proteintransport zwischen ER und Golgi-Apparat unumstritten ist, konnte ihre Existenz in Pflanzen bis zum Beginn der vorliegenden Arbeit noch nicht nachgewiesen werden. Die Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen aus verschiedenen Pflanzen, die Homologien zu den Hüllproteinen der COP Vesikel von Hefen und Säugetieren aufweisen, führte zu der Hypothese, daß auch in Pflanzen ein COP Vesikel vermittelter Proteintransport existiert.Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit durch biochemische und zellbiologische Methoden in einem in vitro Versuchssystem die Bildung von pflanzlichen COP Vesikeln untersucht. Hierbei konnte die Spezifität der Rekrutierung der Hüllproteine der COPI Vesikel in Abhängigkeit von ATP und GTP-gamma-S nachgewiesen werden. Weiterhin konnte eine angereicherte COPI Vesikel Fraktion isoliert und somit auch die Existenz pflanzlicher COPI Vesikel bewiesen werden. Als ein Frachtmolekül der in vitro induzierten COPI Vesikel wurde das ER residente Protein Calreticulin identifiziert. Dieses ließ auf eine Beteiligung der COPI Vesikel am retrograden Proteintransport vom Golgi-Apparat zum ER schließen und unterstützt die Hypothese, daß die Retention löslicher Proteine im ER nicht durch die Verhinderung ihres Exports, sondern durch einen selektiven Rücktransport von einem post-ER Kompartiment erfolgt.Aus diesem Grund wurde die Selektivität des ER Exports löslicher Proteine in einem in vivo Versuchssystem untersucht. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnte erstmals die Beteiligung von COPII Vesikeln am Export löslicher Proteine aus dem ER in Pflanzen nachgewiesen werden. Am Beispiel des sekretorischen Proteins alpha-Amylase, des "bulk-flow" Markers Phosphinothricin-Acetyltransferase (PAT) und des ER residenten Proteins Calreticulin konnte weiterhin gezeigt werden, daß der ER Export nicht auf einem selektiven Mechanismus basiert, sondern durch "bulk-flow" erfolgt.Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß die Retention von ER residenten Proteinen nicht durch die Verhinderung ihres ER Exports, sondern durch einen selektiven Rücktransport aus demcis-Golgi-Apparat erreicht wird.