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dc.contributor.advisor Hirsch-Ernst, Karen PD Dr. de
dc.contributor.author Jakimenko, Ana de
dc.date.accessioned 2012-04-16T14:56:51Z de
dc.date.available 2013-01-30T23:50:32Z de
dc.date.issued 2006-07-28 de
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AC68-A de
dc.description.abstract Abcb6 (rAbcb6) ist ein ABC-Halbtransporter der ABCB-Subfamilie und benötigt einen Dimerisationspartner, um seine Funktion ausüben zu können. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Identifizierung eines Dimerisationspartners für rAbcb6. Aufgrund der Sequenzhomologie zwischen menschlichem ABCB7 und ABCB6 kam Ratten-Abcb7 als putativer Dimerisationspartner für rAbcb6 in Betracht. Während des Klonens der rAbcb6 cDNA Sequenz wurden - abgesehen von der Wildtyp-Sequenz - immer wieder cDNAs gefunden, die im Vergleich zu der Referenzsequenz insgesamt 14 einzelne Nukleotidänderungen aufwiesen. Zum ersten Mal wurde die gesamte Länge der als rAbcb7 cDNA kodierenden Sequenz geklont und in der EMBL Datenbank unter der Zugangsnummer AJ621255 abgelegt. Der Vergleich der rAbcb6- und rAbcb7-mRNA-Expression zeigte, dass rAbcb7 am stärksten im Herz exprimiert wurde, rAbcb6 dagegen am höchsten im Testis, obwohl beide ubiquitär in den Organen der Ratte angezeigt waren. Die von rAbcb6 und rAbcb7 cDNR abgeleiteten Proteine zeigten 41% Übereinstimmung der Aminosäuresequenz. Expressionsvektoren, die für rAbcb6-EGFP, rAbcb6-V5, rAbcb6-DsRed2, rAbcb7-EGFP, rAbcb7-V5 und rAbcb7-DsRed2 Fusionsproteine kodieren, wurden kloniert und bei der transienten Transfektion von Säugetierzellen verwendet.In transienten kotransfizierten menschlichen LoVo-Zellen wurde keine signifikante Kolokalisierung zwischen grün fluoreszierendem rAbcb6-EGFP und rot fluoreszierendem rAbcb7-DsRed2 festgestellt. Außerdem brachte das rAbcb6-Protein ein punktförmiges Muster hervor, das rAbcb7-Protein dagegen ein wurmförmiges Expressionsmuster. Weitere Experimente haben gezeigt, dass das Verteilungsmuster von V5-, EGFP- order DsRed2-getagtem rAbcb6 und rAbcb7 tag-unabhängig war. LoVo- und Maus-TM3-Zellen wurden mit einem rAbcb6-EGFP-Protein kodierenden Vektor und einem Organellmarkerprotein kodierenden Vektor (DsRed getagter mitochondrialer Marker order lysosomaler/spät endosomaler Marker Lamp1-DsRed) transient kotransfiziert. Nahezu keine Kolokalisierung wurde zwischen rAbcb6-EGFP und dem mitochondrialen Markerprotein beobachtet, aber in beide Zelllinien zeigte das Verteilungsmuster von rAbcb6-EGFP zeigten eine beträchtliche Überlappung mit Lamp1-DsRed. rAbcb7-EGFP kolokalisierte mit mitochondrialen Marker in LoVo- und HEK293-Zellen, die beide Fusionsproteine exprimierten.Die Western-Blot-Analyse von fraktionierten Zellhomogenaten, die getagtes rAbcb7 oder getagtes rAbcb6 beinhalteten, zeigte, dass rAbcb7-V5 (mit elektrophoretischer Mobilität entsprechend 70 kDa) in einer Fraktion, die bei 10,000 x g sedimentiert wurde, angereichert war, während der Großteil von rAbcb6-V5 (80 105 kDa) oder rAbcb6-EGFP (110 130 kDa) in der Fraktion gefunden wurde, die bei 18,000 x g sedimentiert war. rAbcb6-EGFP- und rAbcb6-V5-Fusionsproteine wurden aus den Extrakten von transient kotransfizierten TM3-, LoVo- und HEK293-Zellen koimmunopräzipitiert, ebenso rAbcb7-EGFP und rAbcb7-V5 als Koimmunopräzipitat in LoVo- und HEK293-Zellen, was darauf hinweist, dass rAbcb6 und rAbcb7 Homodimere bilden. Keine Anzeichen gab es hingegen für eine Koimmunopräzipitation von rAbcb6- mit rAbcb7-Fusionsproteinen, was darauf hindeutet, dass eine Heterodimerisation von diesen beiden Proteinen unwahrscheinlich ist. de
dc.format.mimetype application/pdf de
dc.language.iso eng de
dc.rights.uri http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html de
dc.title Localization and dimerization of the ABC half transporter rAbcb6 as compared to rAbcb7 de
dc.type doctoralThesis de
dc.title.translated Lokalisation und Dimerisation des Ratten-ABC-Halbtransporters, rAbcb6 im Vergleich zu rAbcb7 de
dc.contributor.referee Kramer, Wilfried PD Dr. de
dc.date.examination 2006-07-06 de
dc.subject.dnb 570 Biowissenschaften, Biologie de
dc.description.abstracteng Rat Abcb6 (rAbcb6) is an ABC half transporter of the ABCB subfamily and is expected to require a dimerization partner to perform its function. The main aim of this thesis was to detect a dimerization partner of rAbcb6. Due to sequence homology between human ABCB7 and ABCB6, rat Abcb7 was considered as a putative dimerization partner for rAbcb6. During the re-cloning of the rAbcb6 cDNA sequence, besides the wild-type sequence, cDNAs were consistently found, exhibiting in total 14 single nucleotide changes as compared to the reference rAbcb6 cDNA EMBL database sequence. The full length coding rAbcb7 cDNA was cloned for the first time and deposited in the EMBL database under accession number AJ621255. Comparison of rAbcb6 and rAbcb7 mRNA expression showed that rAbcb7 was most abundantly expressed in the heart, whereas rAbcb6 expression was highest in the testis, although both showed ubiquitous expression in rat organs. Proteins deduced from rAbcb6 and rAbcb7 cDNA sequences demonstrated 41% amino acid sequence identity. Expression vectors yielding rAbcb6-EGFP, rAbcb6-V5, rAbcb6-DsRed2, rAbcb7-EGFP, rAbcb7-V5 and rAbcb7-DsRed2 fusion proteins were constructed and used for transient transfection of mammalian cells.In transiently co-transfected human LoVo cells no substantial co-localization was detected between green fluorescent rAbcb6-EGFP and red fluorescent rAbcb7-DsRed2. Moreover, the tagged rAbcb6 protein yielded a punctated pattern, whereas tagged rAbcb7 protein exhibited a vermiform pattern. Further experiments provided evidence that the distribution pattern of V5-, EGFP- and DsRed2-tagged rAbcb6 and rAbcb7 was tag independent. LoVo and mouse TM3 cells were transiently co-transfected with rAbcb6-EGFP protein encoding vector and organelle marker protein encoding vector (DsRed-tagged mitochondrial marker or lysosomal/late endosomal marker Lamp1-DsRed). Almost no co-localization was observed between rAbcb6-EGFP and the mitochondrial marker protein, but in both cell lines the rAbcb6-EGFP distribution pattern showed a considerable overlap with Lamp1-DsRed. The rAbcb7-EGFP was found to co-localize with the mitochondrial marker in LoVo and HEK293 cells expressing both rAbcb7-EGFP and fluorescent mitochondrial marker.Western blot analyses of fractionated cell homogenates containing tagged rAbcb7 or tagged rAbcb6 revealed that rAbcb7-V5 (with an electrophoretic mobility corresponding to 70 kDa) was enriched in the fraction sedimented at 10,000 x g, whereas the majority of rAbcb6-V5 (80 - 105 kDa) or rAbcb6-EGFP (110 - 130 kDa) was found in the fraction sedimented at 18,000 x g. rAbcb6-EGFP and rAbcb6-V5 fusion proteins were co-immunoprecipitated from extracts of transiently transfected TM3, LoVo and HEK293 cells. Similarly, rAbcb7-EGFP and rAbcb7-V5 were found to co-immunoprecipitate in LoVo and HEK293 cells, suggesting that rAbcb6 and rAbcb7 form homodimers. No evidence was obtained for co-immunoprecipitation of rAbcb6 and rAbcb7 fusion proteins, indicating that heterodimerization of these two proteins is unlikely. de
dc.contributor.coReferee Ficner, Ralf Prof. Dr. de
dc.subject.topic Mathematics and Computer Science de
dc.subject.ger ABC-Halbtransporter de
dc.subject.ger ABCB-Subfamilie de
dc.subject.ger Abcb6 de
dc.subject.ger rAbcb6 de
dc.subject.ger Abcb7 de
dc.subject.ger rAbcb7 de
dc.subject.ger mRNA-Expression de
dc.subject.ger Lokalisation de
dc.subject.ger Dimerisation de
dc.subject.ger Homodimerisation de
dc.subject.eng ABC half transporter de
dc.subject.eng rat Abcb6 de
dc.subject.eng rAbcb6 de
dc.subject.eng rat Abcb7 de
dc.subject.eng rAbcb7 de
dc.subject.eng localization de
dc.subject.eng dimerization de
dc.subject.eng homodimer de
dc.subject.eng mRNA expression de
dc.subject.bk 42.13 Molekularbiologie de
dc.subject.bk 42.15 Zellbiologie de
dc.identifier.urn urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-780-7 de
dc.identifier.purl webdoc-780 de
dc.affiliation.institute Biologische Fakultät inkl. Psychologie de
dc.subject.gokfull WF 200: Molekularbiologie de
dc.subject.gokfull WHC 500: Organellen, Zellorganellen {Cytologie} de
dc.identifier.ppn 487854020 de

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