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dc.contributor.advisor Griesinger, Christian Prof. Dr. de
dc.contributor.author Vijayan, Vinesh de
dc.date.accessioned 2007-05-29T15:07:35Z de
dc.date.accessioned 2013-01-18T10:37:32Z de
dc.date.available 2013-01-30T23:51:24Z de
dc.date.issued 2007-05-29 de
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AC91-C de
dc.description.abstract Zwei-Komponenten regulatorische Systeme sind die häufigsten Systeme für transmembrane Signaltransduktion in Bakterien und spielen eine Hauptrolle bei der zellulären Adaptation an die Bedingungen der Umwelt und Stress. Sie bestehen aus zwei verschiedenen Proteinen, einer sensorischen Histidinkinase, die normalerweise in der Membran lokalisiert ist, und einem verwandten Antwortregulator im Cytoplasma. Für diese Systeme gibt es eine Fülle von molekularbiologischen Studien. Trotzdem sind keine Strukturinformationen über die transmembrane Signaltransduktion vorhanden. Das Ziel dieser Untersuchung war es, Informationen über die Struktur und Dynamik der Signalerkennung und -transduktion von der periplasmatischen sensorischen Domäne über den membranständigen zwei-Komponenten Sensor in die cytoplasmatische Domäne zu erhalten. In dieser Arbeit werden Strukturuntersuchungen mittels NMR an der periplasmatischen Domäne von zwei Histidinkinasen präsentiert. DcuS und CitA sind bakterielle Sensorhistidinkinasen, die eine transmembrane Domäne besitzen. Sie sind Teil eines zwei-Komponenten Signaltransduktionssystems, das den Transport und Metabolismus von Di- und Tri-Carboxylaten in Abhängigkeit ihrer Konzentration in der Umgebung regulieren. Ihre periplasmitischen Domänen (DcuS-PD und CitAP) sind homolog, haben eine PAS-Domäne und eine Bindungsstelle für die Carboxylate. CitA fungiert als ein hochspezifischer Citratrezeptor während DcuS von einer Reihe von C4-Dicarboxylaten wie Fumarat und Succinat stimuliert wird. Als ein erster Schritt in Hinblick auf die Aufklärung des Signaltransduktionsprozesses wurde die Lösungs-NMR-Struktur der periplasmatischen Domäne von DcuS gelöst. Die Struktur wurde mit residualen dipolaren Kopplungen (RDCs), die über eine neuartige Strategie zur simultanen Messung von RDCs mit minimalem Resonanzüberlap gemessen wurden, verfeinert. Die Bindungstasche von DcuS-PD für einige C4 Di-Carboxylate wurde mittels 15N-1H HSQC basierter Titrationen definiert. Der Einfluss der Ligandenbindung an DcuS-PD war schwach.Weder Veränderungen der chemischen Verschiebungen noch Anstieg der Signalintensitäten für Reste außerhalb der Bindungstasche wurden beobachtet. Deshalb blieb der Mechanismus der Signalransduktion ungewiss. Lösungs-NMR-Strukturen von CitAP konnten aufgrund starker Linienverbreiterung, die in den NMR-Spektren beobachtet wurde, nicht gelöst werden. Konformationeller Austausch war der Hauptgrund der Linienverbreiterung. Die Kristallstrukturen der citrat-freien und gebundenen Form von CitAP konnten aufgeklärt werden. Hauptunterschiede wurden in der Citratbindungsregion und in der C-terminalen Region des Proteins beobachtet. Zusätzlich veränderten sich die chemischen Verschiebungen und die HetNOE-Werte in diesen Teilen des Proteins stark. In der citrat-gebundenen Struktur wurde ein Na+-Ion zwischen die Nterminale Helix und die beta-Faltblätter gesetzt. Das wurde auch durch NMR-Titrationen bestätigt. Damit könnte CitAP in Lösung sowohl an der Erkennung von Citrat als auch von Na+ beteiligt sein. Überraschenderweise passen die für cirtatfreies CitAP gemessenen RDCs besser zu der citratgebundenen Struktur von CitAP. Das deutet darauf hin, dass in Lösung eine vorgeformte Bindungstasche von CitAP vorliegt. Nichtsdestotrotz ermöglichten die spezifische strukturellen Unterschiede zwischen der citratfreien und den -gebundenen Strukturen den Vorschlag eines Modells für den Mechanismus der Signaltransduktion. Dieses Modell passt zu den verfügbaren NMR-Daten und ist auch ähnlich zu dem für Aspartatsensoren beschriebenen Mechanismus der Signaltransduktion. de
dc.format.mimetype application/pdf de
dc.language.iso eng de
dc.rights.uri http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html de
dc.title NMR structural studies on the periplasmic domain of CitA and DcuS. de
dc.type doctoralThesis de
dc.title.translated Strukturuntersuchungen an der periplasmatischen Domäne von CitA und DcuS mit NMR-Spektroskopie de
dc.contributor.referee Suhm, Martin Prof. Dr. de
dc.date.examination 2007-05-03 de
dc.subject.dnb 540 Chemie de
dc.description.abstracteng Two-component regulatory system represent the most frequent system for transmembrane signaling in bacteria and play a major role in the cellular adaptation to environmental conditions and stress. They consist of two separate proteins, a sensory histidine protein kinase which is located typically in the membrane, and a cognate response regulator in the cytoplasm. Despite the wealth of molecular biological studies in these systems, no structural informations are available on the signal transduction by these systems across the membrane. The aim of the study was to gain structural and dynamic information on signal perception and signal transduction from the periplasmic sensor domain of the two component membraneous sensor into the cytoplasmic domain. In this thesis NMR structural studies on the periplasmic domain of two histidine kinase are presented. DcuS and CitA are bacterial membraneous sensory histidine kinases. They are part of a two component signal transduction systems that regulate the transport and metabolism of di- and tri-carboxylates in response to their environmental concentration. Their periplasmic domains (DcuS-PD and CitAP), are homologous, share a PAS fold, and contain the binding site for the carboxylates. CitA works as a highly specific citrate receptor whereas DcuS uses a wider range of C4 dicarboxylates like fumarate, succinate etc as stimulus. As a first step to understand the signal transfer process, the NMR solution structure of periplasmic domain of DcuS was determined. The structure was refined with residual dipolar couplings (RDCs), measured using a novel strategy for simultaneous measurement of RDCs with minimum resonance overlap. The binding pocket of DcuS-PD for C4 di-carboxylates was defined using 15N-1H HSQC based titrations. The effect of the ligand binding to DcuS-PD was weak. No chemical shift changes or intensity increase for residues were observed outside the binding pocket and hence the signal transduction mechanism remained undetermined. Therefore the sensory domain of CitAP which binds citrate more specifically was studied to obtain a better understanding of the conformational changes that lead to signal transduction. The NMR solution structures of CitAP could not be determined because of the large number of missing peaks due to severe line broadening observed in the NMR spectra. Conformational exchange was the major cause of line broadening. However the X-ray structures of citrate free and bound form of CitAP could be determined. The major conformational changes were observed in the citrate binding region and in the C-terminal region of the protein. Large chemical shift changes and Het-NOE values were also observed in these parts of the protein. In the citrate bound structure, a Na+ ion was tentatively localized between N terminal helix and the beta-sheets. This was also confirmed by NMR titrations. Hence CitAP may be involved in sensing both citrate and Na+ ion in solution. Surprisingly the RDCs measured for citrate free CitAP fit better with citrate bound structure of CitAP. This indicates a pre-formed binding pocket of CitAP in solution. Nevertheless, the specific structural differences between the citrate free and bound structures allowed to formulate a model for the mechanism of signal transduction. This model is consistent with available NMR data and also very similar to the signal transduction mechanism described for aspartate sensors. de
dc.subject.topic Mathematics and Computer Science de
dc.subject.ger NMR-Spektroskopie de
dc.subject.ger Protein Strukturuntersuchung de
dc.subject.ger DcuS de
dc.subject.ger CitA de
dc.subject.ger PAS domäne de
dc.subject.ger RDC de
dc.subject.ger Pulssequenz de
dc.subject.eng NMR-Spectroscopy de
dc.subject.eng Protein structural studies de
dc.subject.eng DcuS de
dc.subject.eng CitA de
dc.subject.eng PAS domaine de
dc.subject.eng RDC de
dc.subject.eng Pulse sequence de
dc.subject.bk 35.25 de
dc.identifier.urn urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1478-4 de
dc.identifier.purl webdoc-1478 de
dc.affiliation.institute Fakultät für Chemie de
dc.subject.gokfull S de
dc.identifier.ppn 550648607 de

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