Biophysikalische und thermodynamische Charakterisierung der neuronalen SNARE-Komplexbildung

Abstract

Membranfusionsereignisse werden durch eine konservierte Proteinfamilie, die so genannten SNARE-Proteine, vermittelt. SNARE-Proteine bilden einen stabilen α-helikalen Komplex zwischen zwei Membranen aus. Dabei bilden die plasmamembranständigen Proteine SNAP-25 und Syntaxin einen Akzeptorkomplex für das in der Vesikelmembran sitzende Synaptobrevin aus. Man geht davon aus, dass sich aufgrund dieser Komplexbildung die Membranen annähern und so letztendlich deren Fusion induziert wird. Der genaue Ablauf dieser Reaktionen, sowie mögliche Intermediate der Komplexbildung, konnte bisher nicht vollständig aufgeklärt werden. Um zu einem tieferen Verständnis des Ablaufs der SNARE-vermittelten Membranfusion beizutragen, wurden in dieser Arbeit die einzelnen Schritte der SNARE-Komplexbildung in vitro anhand von biophysikalischen Methoden, wie CD- und Fluoreszenzspektroskopie charakterisiert. Zusätzlich wurde die SNARE-Komplexbildung thermodynamisch mittels Isothermaler Titrationskalorimetrie untersucht. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde die Interaktion von Syntaxin und SNAP-25 untersucht, die einen Akzeptorkomplex f¨ur Synaptobrevin bilden. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Bildung des Q-SNARE-Akzeptorkomplexes geschwindigkeitsbestimmend für die nachfolgenden Schritte ist. Mittels zielgerichteter Mutationen in SNAP-25 wurde gezeigt, dass die N-terminalen Regionen der drei Q-SNARE-Helices für die Komplexbildung entscheidend sind. Weitere thermodynamische Analysen ergaben, dass die langsame Q-SNARE-Akzeptorbildung möglicherweise in vivo durch einen priming factor beschleunigt wird. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der nachfolgenden Synaptobrevinbindungsreaktion. In diesem Schritt bindet Synaptobrevin an den Q-SNARE- Akzeptorkomplex, jedoch kann in vitro ein zweites Syntaxinmolekül die Bindungsstelle von Syntaxin blockieren. Dieses experimentelle Problem wurde mit der Verwendung eines stabilisierten Akzeptorkomplexes umgangen, bei dem ein C-terminales Synaptobrevinpeptid einen Komplex mit Syntaxin und SNAP-25 bildet. Dieser stabilisierte Akzeptorkomplex bietet eine freie N-terminale Synaptobrevinbindungsstelle und nach der Bindung von Synaptobrevin kann das C-terminale Synaptobrevinfragment aus dem Verbund verdrängt werden. Durch Mutationen sowohl im Bindungsbereich des Akzeptorkomplexes als auch in Synaptobrevin, konnte der Bindungsschritt erstmals in vitro detailiert analysiert werden. Der N-terminale Bereich von Synaptobrevin wurde als essenziell für die ternäre SNARE-Komplexbildung identifiziert. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass im Gegensatz zu anderen Synaptobrevinhomologen, das regulatorische R-SNARE-Protein Tomosyn nicht an die Bindungsstelle für Synaptobrevin im stabilisierten Akzeptorkomplex binden kann. Auch wurde der C-terminale Aufrollschritt, der auf die Synaptobrevinbindung folgt, im dritten Teil dieser Arbeit näher charakterisiert. Dabei konnte CD-spektroskopisch gezeigt werden, dass sich SNARE-Komplexe mit C-terminalen Mutationen in zwei Phasen entfalten. Dies gibt einen strukturellen Hinweis darauf, dass ein C-terminal destabilisierter SNARE-Komplex existieren kann. Anhand von thermodynamischen Untersuchungen wurde außerdem deutlich, dass die C-terminale Faltungsreaktion reversibel sein könnte und demnach nicht die treibende Kraft der Membranfusion sein kann, sondern weitere regulatorische Proteine für diesen Schritt nötig sind.