Determination of Genetic Interactions Required for Dystrophin-Dystroglycan Function and Regulation in a Drosophila Model of Muscular Dystrophy

Abstract

Im Menschen hängen genetisch diverse Formen von Muskeldystrophie (MD) mit einer Schädigung des Dystrophin-Glykoprotein Komplexes (DGC) zusammen. Der DGC besteht aus Dystrophin, Dystroglykanen, Sarkoglykanen, Sarkospan, Syntrophinen und Dystrobrevin. Die Charakterisierung des Drosophila melanogaster DGC zeigt, dass die Fliege alle wesentlichen Bestandteile des DGC aufweist, jedoch in wesentlich geringerer Komplexität. Mutationen in den Dystrophin (Dys), Dystroglykan (Dg) und Sarkoglykan Genen der Fliege verursachen Symptome ähnlich denen beim Menschen: verminderte Mobilität, verkürzte Lebenserwartung sowie altersabhängige Muskeldegeneration. Des Weiteren beeinflussen Mutationen in Dys und Dg die Freisetzung von Neurotransmittern in der neuromuskulären Endplatte und rufen axonale Migrationsdefekte hervor. Weiterhin sind Dys und Dg wichtig bei der Festlegung der Zellpolarität in Keimbahn- und Follikelzellen. Da eine Störung der Interaktion zwischen Bestandteilen des DGC im Menschen Muskeldystrophie hervorruft, haben wir uns entschieden die Wechselwirkung zwischen den beiden DGC Hauptkomponenten, DYS und DG, genauer zu untersuchen. Der C-Terminus von DG enthält einige Bindungsstellen für SH3-, SH2- und WW-Domänen. Es wurde gezeigt, dass das C-terminale PPxY-Motiv in DG die WW-Domäne von DYS binden kann. Unsere in vitro Studien zeigen, dass beide PPxY-Motive in Drosophila DG, WWbsI und WWbsII, an die WW-Domäne in DYS binden können und dass eine Phosophorylierung des Tyrosins in jedem der PPxY-Motive zur Aufhebung der DG-DYS Bindung führt. Dies deutet auf einen möglichen Regulationsmechanismus hin. Außerdem haben wir gezeigt, dass beide WW-Bindungsstellen erforderlich sind um die DG Funktion bei der Festlegung der Polarität der Eizelle aufrecht zu erhalten. Der Vergleich der Sequenzen von WW-Bindungsstellen in 12 Drosophila Spezies und dem Menschen zeigt außerdem, dass diese Stellen hochgradig konserviert sind. Daher schlagen wir vor, dass das Vorhandensein von zwei WW-Bindungsstellen in DG die essentielle Bindung zwischen DG und DYS sicherstellt und eventuell eine weitere Regulationsebene für die Zytoskelettumlagerungen darstellen könnte, an denen der DGC beteiligt ist. Um neue Komponenten zu finden, die mit dem DGC interagieren oder seine Funktion regulieren, haben wir ein Drosophila Modell für MD benutzt und genetische Screens durchgeführt bei denen wir dominante Modulatoren von Dg und Dys Mutationsphänotypen identifiziert haben. Im groß angelegten Primär-Screen haben wir nach Modifikationen von einfach zu bewertenden Phänotypen gesucht, wie zum Beispiel der Veränderung der posterioren Flügel-Querader. Mit dieser Vorhergehensweise haben wir Modulatoren gefunden, die zu unterschiedlichen funktionellen Gruppen gehören: Gene die Funktionen im Muskelgewebe, bei neuronaler/zellulärer Migration oder als Motorproteine besitzen, sowie Komponenten des Zytoskeletts und Mitglieder der TGF-β-, EGFR- und Notch- Signalwege. Um die Mechanismen der Muskeldegeneration aufzuklären die durch eine verminderte Dys und Dg Funktion verursacht werden, wurde ein Sekundär-Screen in Muskelgewebe durchgeführt. Dabei wurden Modulatoren identifiziert, die den Phänotyp der Muskeldegeneration jeweils unterdrückten oder verstärkten. Weiterführende Untersuchungen der identifizierten Komponenten zeigten, dass diese entweder im Muskel- oder Nervengewebe benötigt werden, wo dann spezifische Interaktionen mit Bestandteilen des DGC auftreten können. Diese neuen Komponenten, die zu DGC abhängiger Muskelerhaltung beitragen, werden gegenwärtig analysiert.