Biochemische, molekularbiologische und genetische Untersuchungen über strukturelle Voraussetzungen für DNA U-Endonukleaseaktivität in der ExoIII-Familie von DNA Reparaturenzymen

Abstract

Eins der gravierendsten Probleme in jedem Organismus sind die spontane hydrolytische DNA-Schäden. Das Problem der DNA-U-Reparatur wurde bis heute sorgfältig in thermophilen und hyperthermophilen Archaeen untersucht. Dabei wurde ein neuartiger Reparaturweg entdeckt, der von einer DNA-U Endonuklease (Mth212, ein ExoIII Homolog) initiiert wird. Zum besseren Verständnis des möglichen evolutiven Weges der DNA-U-Reparatur sowie für die Aufklärung der Fragen, ob dieser Reparaturweg von den extremen Lebensbedingungen abhängig ist und welche strukturelle Besonderheit die U-Endonukleaseaktivität von Mth212 bestimmt, wurde ein mesophiles ExoIII-Homolog (Mma3148) mit hoher Sequenzverwandtschaft zu Mth212 untersucht. Das ExoIII-Homolog Mma3148 stammt aus dem mesophilen Archaeon Methanosarcina mazei. Die Untersuchung des Genoms von M. mazei hat folgende Ergebnisse geliefert. M. mazei ist mit zwei open reading frames ausgestattet, deren Produkte als Kandidaten für die Initiation der DNA-U-Reparatur betrachtet werden können: ein TUDGA-Homolog (Mma0486) (Familie 4) und ein ExoIII-Homolog (Mma3148). Das TUDGA-Homolog besitzt alle Eigenschaften der Uracil-DNA-Glykosylase Familie 4. Es ist allerdings erstaunlich, dass das Protein von 37°C bis zu 77°C aktiv bleibt. Mma3148 hat die typischen Eigenschaften eines ExoIII-Homologs. Zusätzlich zeigt das Protein Aktivität gegenüber biologisch irrelevanten U/T und U/C Fehlpaarungen, nicht aber gegenüber U/G. Aufgrund der Analyse eines multiple sequence alignments von Mth212 mit der ExoIII-Familie und der 3D Struktur bereits kristallisierter ExoIII-Enzyme wurden bei M. mazei ExoIII zwei Aminosäuren ausgetauscht, was zur generellen Steigerung aller Aktivitäten und damit zu einer schwachen, aber deutlich detektierbaren Aktivität gegenüber U/G geführt hat. Für die Untersuchung, ob die Doppelmutante genetisch nachweisbar einen DNA-U-Reparaturweg in vivo einleiten kann, wurde ein U-DNA-Reparaturexperiment in vivo im heterologen E. coli-Hintergrund mit Hilfe eines M13-heteroduplex-DNA-Konstruktes durchgeführt. Zuerst wurde mit Hilfe eines Komplementationsexperimentes gezeigt, dass das archaeelle Protein in E. coli funktionsfähig ist. Das U-DNA-Reparaturexperiment hat einen schwachen Hinweis auf Beteiligung der Doppelmutante an der U/G-Reparatur ergeben. In Zusammenarbeit mit Kristina Lakomek wurde die Arbeitshypothese zur Erkennung des Uracilrests durch Mth212 durch Austausch bestimmter Aminosäurereste untersucht. Daraus wurde folgende Schlussfolgerung gezogen: Die Insertion einer Argininseitenkette (Arg209) in die Basenstapelung spielt vermutlich eine entscheidende Rolle bei der Erkennung eines dU-Restes. Im Licht dieser Befunde wurde die Evolution der DNA-U-Reparatur in der archaeellen Domäne folgenderweise betrachtet: Die DNA-U-Reparatur wurde ursprünglich von einem ExoIII-Homolog ausgeführt, dessen U-Endoaktivität durch den evolutiv späteren Erwerb eines TUDGA-Homologs überflüssig wurde und anschließend durch genetische Drift verloren ging. Da das Mma3148 Protein nur biologisch nicht relevante U-Aktivität besitzt, wurde dieses Enzym als eine evolutive Zwischenstufe betrachtet.