Investigation of glycolysis in Bacillus subtilis

Abstract

Bacillus subtilis ist ein Modellorganismus für Gram-positive Bakterien mit Relevanz für die Biotechnologie. Die intensive Erforschung dieses Bakteriums macht es zu einem der am besten untersuchten Prokaryonten im Bereich der Molekular- und Zellbiologie. Obgleich dieses Bakterium gut untersucht ist, sind noch viele Fragen in Bezug auf Genfunktionen und posttranslationen Modifikationen offen. Unter den posttranslationen Modifikationen besitzen Proteinphosphorylierungen ein großes regulatorisches Potential. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass die Phosphorylierung von Proteinen an Serin-, Threonin- und Tyrosin-Resten innerhalb der Bakterien weit verbreitet ist, so auch in Bacillus subtilis. Ziel dieser Arbeit war es, den Ursprung und die Funktion der Serin-, Threonin- und Tyrosin- Phosphorylierung in Bacillus subtilis näher zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden Mehrfach- Kinasemutanten konstruiert und deren Phosphoproteome untersucht. Jedoch zeigten diese Mutanten keine Unterschiede im Phosphoproteom, verglichen mit dem Wildtyp. Deshalb wurde angenommen, dass unbekannte Kinasen oder andere Mechanismen der Phosphorylierung existieren. In dieser Arbeit wurden verschiedene Proteine, die sich autophosphorylieren, identifiziert. So wurde Autophosphorylierung der konservierten GTP-bindenden Proteine Obg und YdiB in Abhängigkeit von GTP bzw. ATP nachgewiesen. Außerdem konnte die Autophosphorylierung der essentiellen Mutasen, Phosphoglyceratmutase (Pgm) und Phosphoglucosaminmutase (GlmM) an konservierten Serin-Resten nachgewiesen werden. Die Autophosphorylierung dieser Enzyme ist Bestandteil ihrer enzymatischen Aktivität und somit unabhängig von Proteinkinasen. Diese Ergebnisse bestätigen die Vermutung, dass nicht alle Phosphorylierungsereignisse in B. subtils durch Proteinkinasen vermittelt werden, wobei die Existenz weiterer, unbekannter Proteinkinasen nicht ausgeschlossen werden kann. Proteine können somit auch in Folge der Interaktion mit energiereichen Phosphatträgern und enzymatische Aktivität phosphoryliert werden. In früheren Arbeiten wurden annähernd alle Gene die für die Enzyme der Glykolyse kodieren als essentiell eingestuft. In dieser Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass jedes einzeln glykolytische Gen deletiert werden kann. Darüber hinaus ist es möglich Kombinationen dieser Mutanten zu konstruieren, die ebenfalls lebensfähig sind. In Wachstumsversuchen wurde gezeigt, dass die hergestellten Einzelmutanten auf Minimalmedium mit Glukose und Malat wachsen können. Für die Phosphofruktokinase Mutante (ΔpfkA) und die Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase Mutante (ΔgapA) wurde Wachstum mit Glukose als alleinige C-Quelle festgestellt. Aus unbekannten Gründen wurde lange Zeit angenommen, dass alle glykolytischen Gene essentiell seien. In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal Mutanten aller einzelnen glykolytischen Gene hergestellt. Diese Mutante bilden eine hervorragende Grundlage für weitere Studien über den Stoffwechsel von B. subtilis.