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Funktionelle Charakterisierung potentieller Pathogenitätsfaktoren aus Pseudomonas aeruginosa mittels biochemischer und evolutiver Methoden

functional characterization of potential pathogenicity factors from Pseudomonas aeruginosa by biochemical and evolutionary methods

by Thorsten Adams
Doctoral thesis
Date of Examination:2005-01-27
Date of issue:2005-07-15
Advisor:PD Dr. Harald Kolmar
Referee:PD Dr. Wilfried Kramer
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Streit
Referee:Prof. Dr. Ernst A. Wimmer
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-488

 

 

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Name:adams.pdf
Size:4.31Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

Three novel potential pathogenicity factors from the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa were characterized functionally and biochemically. The P. aeruginosa mutant 41D3 carries a transposon integration in the Pa5349 gene coding for a rubredoxin reductase. This mutant shows an increased sensitivity towards reactive oxigen species. It could be demonstrated that Pa5349 is an essential component in an electron transfer chain playing a central role in the detoxification of superoxide. Furthermore, evidence for the presence of a superoxide reductase in Pseudomonas aeruginosa could be accumulated, a class of enzymes previously known only from anaerobic and microaerophilic bacteria. Another mutant carried a transposon integration in the Pa0740 gene and lost the ability to reduce the amount of the Quorum Sensing molecule acyl-homoserin lactone. The Pa0740 protein was investigated for a acyl-homoserin lactone degrading activity which could not be demonstrated. The protein Pa1572 that was identified in a third mutant is annotated as conserved hypothetical protein and contains a conserved domain with homology to the ATP-NAD-kinase family. It could be demonstrated that this protein is a NADPH-dependend oxidoreductase with an yet to be identified acceptor.New methodologies for the proteome-wide investigation of interactions were introduced. These methods were aimed to elucidate the protein interactions within the pathogen in order to understand the role of the novel pathogenicity factors in the context of the infection. To this end, proteins were displayed on the cell surface of E. coli cells via fusion to the outer membrane protein intimin and possibilities and limitations of this system for the detection of protein protein interactions were investigated. It was demonstrated that a cell surface exposition requires the passage of the passenger protein through the outer membrane in an unfolded state. In order the expose proteins with a tendency to fold in the cytoplasm or periplasm on the cell surface, a novel methodology was developed which relies on the release of the passenger protein via partial lysis of a clonal population. As a model experiment, the interaction of the P. aeruginosa protein pair PcrV/PcrG could be demonstrated, providing the groundwork for the proteome-wide screening of protein interaction in pathogenic microorganisms.
Keywords: Pseudomonas aeruginosa; superoxide-reductase; lactonase; bacterial cell surface display; intimin; lysis-display

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Es wurden drei ausgewählte potentielle Pathogenitätsfaktoren aus dem opportunistischen Pathogen Pseudomonas aeruginosa biochemisch und funktionell charakterisiert. Die P. aeruginosa Mutante 41D3 trägt eine Transposonintegration in dem Gen Pa5349, welches für eine Rubredoxin Reduktase kodiert. Diese Mutante zeigt eine erhöhte Sensitivität gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies. Pa5349 konnte eine Funktion in einer Elektronentransportkette zugewiesen werden, welche eine zentrale Rolle in der Reduktion von Superoxidradikalen spielt. Weiterhin konnten erstmals Hinweise auf die Anwesenheit einer Superoxid-Reduktase in Pseudomonas aeruginosa gewonnen werden, einer Klasse von Enzymen, die bisher nur aus anaeroben und mikroaerophilen Mikroorganismen bekannt sind. Eine weitere Mutante trug eine Transposonintegration in dem Gen Pa0740 und war nicht mehr in der Lage, die im Medium befindliche Menge des Quorum Sensing Botenstoffes Acyl-Homoserinlacton (AHL) zu reduzieren. Das Protein Pa0740 wurde im Hinblick auf eine AHL-abbauende Aktivität untersucht, die allerdings nicht nachgewiesen werden konnte. Für das Protein Pa1572, das als konserviertes Protein mit unbekannter Funktion annotiert ist und über eine konservierte Domäne mit hoher Ähnlichkeit zu Proteinen der Familie der ATP-NAD-Kinasen verfügt, konnte gezeigt werden, daß es sich bei diesem Protein um eine NADPH-abhängige Oxidoreduktase handelt, deren Akzeptor in der Zelle bisher noch unbekannt ist. Des weiteren wurden Verfahren aufgezeigt, die es ermöglichen sollten, durch proteomweite Untersuchung der Wechselwirkungen der Proteine des Erregers untereinander, ausgewählte Pathogenitätsfaktoren in das komplexe Geschehen der Infektion funktionell einzuordnen. Hierzu wurden Möglichkeiten und Grenzen aufgezeigt, Proteine zur Untersuchung ihrer Wechselwirkungen mit Partnern via Fusion an das Intiminprotein der äußeren Membran auf der Oberfläche von E. coli Zellen zu präsentieren. Es konnte gezeigt werden, daß eine Zelloberflächenexposition eine Translokation des jeweiligen Pa ssagierproteins durch die äußere Membran in einem ungefalteten Zustand voraussetzt. Um auch solche Proteine, deren zytoplasmatische oder periplasmatische Faltung einem Export entgegensteht, einer Oberflächenexposition zugänglich zu machen, wurde ein neues Verfahren entwickelt, welches auf der Freisetzung des Passagierproteins durch Teillyse einer klonalen Bakterienpopulation beruht. Mit dem Nachweis der Interaktion des P. aeruginosa Proteinpaars PcrV/PcrG wurde der Grundstein für den Einsatz dieses Verfahrens für die proteomweite Durchmusterung von Protein-Protein-Interaktionen pathogener Mikro-organsimen gegeben.
Schlagwörter: Pseudomonas aeruginosa; Superoxid-Reduktase; Lactonase; bakterielle Oberflächenpräsentation; Intimin; Lysis-Display
 

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