Funktionelle Charakterisierung potentieller Pathogenitätsfaktoren aus Pseudomonas aeruginosa mittels biochemischer und evolutiver Methoden

Abstract

Es wurden drei ausgewählte potentielle Pathogenitätsfaktoren aus dem opportunistischen Pathogen Pseudomonas aeruginosa biochemisch und funktionell charakterisiert. Die P. aeruginosa Mutante 41D3 trägt eine Transposonintegration in dem Gen Pa5349, welches für eine Rubredoxin Reduktase kodiert. Diese Mutante zeigt eine erhöhte Sensitivität gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies. Pa5349 konnte eine Funktion in einer Elektronentransportkette zugewiesen werden, welche eine zentrale Rolle in der Reduktion von Superoxidradikalen spielt. Weiterhin konnten erstmals Hinweise auf die Anwesenheit einer Superoxid-Reduktase in Pseudomonas aeruginosa gewonnen werden, einer Klasse von Enzymen, die bisher nur aus anaeroben und mikroaerophilen Mikroorganismen bekannt sind. Eine weitere Mutante trug eine Transposonintegration in dem Gen Pa0740 und war nicht mehr in der Lage, die im Medium befindliche Menge des Quorum Sensing Botenstoffes Acyl-Homoserinlacton (AHL) zu reduzieren. Das Protein Pa0740 wurde im Hinblick auf eine AHL-abbauende Aktivität untersucht, die allerdings nicht nachgewiesen werden konnte. Für das Protein Pa1572, das als konserviertes Protein mit unbekannter Funktion annotiert ist und über eine konservierte Domäne mit hoher Ähnlichkeit zu Proteinen der Familie der ATP-NAD-Kinasen verfügt, konnte gezeigt werden, daß es sich bei diesem Protein um eine NADPH-abhängige Oxidoreduktase handelt, deren Akzeptor in der Zelle bisher noch unbekannt ist. Des weiteren wurden Verfahren aufgezeigt, die es ermöglichen sollten, durch proteomweite Untersuchung der Wechselwirkungen der Proteine des Erregers untereinander, ausgewählte Pathogenitätsfaktoren in das komplexe Geschehen der Infektion funktionell einzuordnen. Hierzu wurden Möglichkeiten und Grenzen aufgezeigt, Proteine zur Untersuchung ihrer Wechselwirkungen mit Partnern via Fusion an das Intiminprotein der äußeren Membran auf der Oberfläche von E. coli Zellen zu präsentieren. Es konnte gezeigt werden, daß eine Zelloberflächenexposition eine Translokation des jeweiligen Pa ssagierproteins durch die äußere Membran in einem ungefalteten Zustand voraussetzt. Um auch solche Proteine, deren zytoplasmatische oder periplasmatische Faltung einem Export entgegensteht, einer Oberflächenexposition zugänglich zu machen, wurde ein neues Verfahren entwickelt, welches auf der Freisetzung des Passagierproteins durch Teillyse einer klonalen Bakterienpopulation beruht. Mit dem Nachweis der Interaktion des P. aeruginosa Proteinpaars PcrV/PcrG wurde der Grundstein für den Einsatz dieses Verfahrens für die proteomweite Durchmusterung von Protein-Protein-Interaktionen pathogener Mikro-organsimen gegeben.