Entwicklung eines HTS-geeigneten Enzymtests für Histondeacetylasen zur Entwicklung von HDAC-Inhibitoren

Abstract

In den letzten Jahren wurde die entscheidende Rolle der Histondeacetylasen (HDAC) bei der Pathogenese von bestimmten Tumoren erkannt und diese folgerichtig als wichtiges molekulares Zielenzym eingestuft. Die Entwicklung von selektiven und hoch potenten Inhibitoren für diese Enzyme wurde damit zum erklärten Ziel der Pharmaforschung. Eine oft verfolgte Strategie zur Entwicklung von neuen Leitstrukturen stellt die Durchmusterung großer chemischer Bibliotheken nach Substanzen dar, die das Zielenzym hemmen (Screening). In den letzten Jahren sind daher verstärkt Bemühungen unternommen worden, die Durchmusterung von Bibliotheken mit hohem Durchsatz (high-throughput screening, HTS) zu automatisieren und zu optimieren. Der Mangel an einem für diese Strategie geeigneten, nicht-radioaktiven, biochemischen Assay stellte bislang ein großes Hindernis in der Entwicklung von HDAC-Inhibitoren (HDACI), wie auch insgesamt bei der biochemischen Charakterisierung dieser Enzymfamilie dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der erste HTS-geeignete, homogene, Fluoreszenz-basierte HDAC-Assay entwickelt, welcher in einem zweistufigem Prozess ein gekoppeltes Enzymsystem und acetylierte peptidische Substrate ausnutzt. Eine Validierung des Assays mit HDAC aus Rattenleber bzw. humaner HDAC8 und Standardinhibitoren sowie die Auffindung von Hemmern in einer kleinen Substanzbibliothek belegte dessen Eignung für HTS-Anwendungen. Der HDAC-Assay konnte im folgenden, vor allem durch die Entwicklung des neuen fluorogenen Substrates Tos-GPK(Ac)-AMC, weiter optimiert werden und erreichte einen Z′-Faktor von 0,8 (96 well) bzw. von 0,47 (1536 well). Darüberhinaus konnten durch in vitro Inhibitionsexperimente auch neue HDACI mit IC50-Werten für HDAC aus der Rattenleber, humane HDAC8 und FB188-HDAH im nanomolaren Bereich identifiziert werden. Für FB188-HDAH kam eine in diesem Fall anwendbare, kontinuierliche Variante des HDAC-Assay zum Einsatz. Darüber hinaus konnten selektive HDACI entwickelt werden, welche entweder präferenziell ein Modellenzym für HDA C der Klasse II hemmen (Faktor 14-29) oder sogar innerhalb der Klasse I-Enzyme differenzieren (Faktor 58). Selektive Inhibitoren sind von großer Bedeutung für die Krebstherapie sowie für die Aufklärung der zellulären Funktion einzelner HDAC. Die Substratspezifität der HDAC wurde im Hinblick auf das Volumen und die Rolle der Ladung der am Lysin der Substrate gekoppelten Reste untersucht. Dabei wurde mit Boc-Lys(Prop)-AMC ein Substrat gefunden, welches zwischen HDAC aus der Rattenleber und HDAC8 bzw. FB188-HDAH diskriminiert. Mit der Entwicklung von Boc-Lys(TFA)-AMC als neuem Substrat für HDAC8 wurde die Möglichkeit erschlossen, Inhibitoren auch für dieses Enzym mittels HTS zu gewinnen. Im Gegensatz zu humaner HDAC1 ließ sich HDAC8 in aktiver Form in E. coli exprimieren und konnte in hinreichender Reinheit und Menge aufgereinigt werden.