Identification of microRNA 302 as an antagonist to p63 expression
Identifizierung von microRNA 302 als Antagonist von p63-Expression
by Andreas Scheel
Date of Examination:2011-06-07
Date of issue:2009-12-18
Advisor:Prof. Dr. Matthias Dobbelstein
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The p53-family of transcription factors is essential in tumor-suppression, during development and in tissue homeostasis. MicroRNAs are small single-stranded RNAs involved in translation control and mRNA stability. To investigate if microRNAs contribute to the regulation of p63 and p53, an immunofluorescence screen was performed. "5637" urothelium carcinoma cells were transfected with a collection of microRNA expression plasmids and cellular p63 and p53 were quantified using semi-automated immunofluorescence. MicroRNAs of the 302 cluster (miR-302) strongly suppressed p63 accumulation in the screen and in all cell lines tested subsequently. MiR-302 expression reduces p63 protein and mRNA levels by direct binding of two target sites within the 3 untranslated region of p63-α and -β mRNAs. In testicular cancer cells, endogenous miR-302 contributes to the suppression of p63. Physiologically, miR-302 might contribute to the elimination of p63 in maturating oocytes. MiR-485 was identified as a putative regulator of p53. In "5637" cells, miR-485 expression reduces levels of mutant p53; expression in "U2OS" osteosarcoma cells reduces wild type p53, inhibits p21 induction upon genotoxic stress and causes elevated levels of γ-phosphorylated H2A.X histone proteins. This interaction seems to be indirect and is cell type specific. It might occur in neurons during increased neuronal activity. The established screening technique could be used to identify regulatory microRNAs for any protein that is amenable to detection by immunofluorescence. As is demonstrated by miR-302 and -485, both direct and indirect regulators may be identified. Also, effects of regulators other than microRNAs such as kinases could be tested for a specific protein.
Keywords: p63; p53; microRNA; testicular cancer
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Die p53-Familie von Transkriptionsfaktoren ist essentiell in der Tumorsuppression, während der Entwicklung und in der Gewebehomöostase. MicroRNAs sind kleine, einzelsträngige RNAs, die an der Translationskontrolle und der mRNA-Stabilität beteiligt sind. Zur Untersuchung, ob microRNAs an der Regulation von p63 und p53 beteiligt sind, wurde eine immunofluoreszenzbasierte Serienuntersuchung durchgeführt. '5637' Urothel-Karzinomzellen wurden mit einer Sammlung von microRNA-Expressionsplasmiden transfiziert und zelluläres p63 und p53 wurden durch halbautomatische Immunofluoreszenz quantifiziert. MicroRNAs des 302 Clusters (miR-302) unterdrückten die p63 Proteinmengen deutlich in dieser Serienuntersuchung und in allen im folgenden getesteten Zell-Linien. Mir-302 Expression reduziert p63 Protein- und mRNA-Mengen durch direkte Interaktion mit zwei Bindungsstellen in der 3' untranslatierten Region von p63-α und β mRNAs. In testikulären Karzinomzellen trägt endogen exprimierte miR-302 zur Suppression von p63 bei. Physiologisch könnte miR-302 zur Eliminierung von p63 während der Maturation von Oozyten beitragen. MiR-485 wurde als vermutlicher Regulator von p53 identifiziert. In '5637'-Zellen reduziert miR-485 Expression die Proteinmenge von mutiertem p53; Expression in 'U2OS'-Osteosarkomzellen reduziert wildtypisches p53, inhibiert p21-Induktion nach genotoxischem Stress und verursacht erhöhte Mengen an γ-phosphoryliertem H2A.X Histonproteinen. Diese Interaktion scheint indirekt zu sein und ist zelltypspezifisch. Sie könnte eine Funktion in Neuronen während gesteigerter neuronaler Aktivität haben. Die etablierte Serienuntersuchungstechnik könnte verwendet werden, um regulatorische microRNAs für jedes Protein zu identifizieren, das sich durch Immunofluoreszenz darstellen läßt. Wie durch miR-302 und -485 demonstriert wird, können sowohl direkte als auch indirekte Regulatoren gefunden werden. Außerdem könnten die Effekte anderer Regulatoren wie z.B. Kinasen auf ein spezifisches Protein untersucht werden.