Der Einfluss von Mycophenolat-Mofetil (MMF) auf die renale Fibrogenese: Bedeutung für neue therapeutische Ansätze
The influence of mycophenolate mofetil on renal fibrogenesis: Relevance for new therapeutic approaches
by Franziska Brehmer
Date of Examination:2011-02-15
Date of issue:2011-02-01
Advisor:Dr. Gunnar Brandhorst
Referee:Prof. Dr. Dr. h.c. Michael Oellerich
Referee:PD Dr. Michael Koziolek
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Within the scope of this study, the potential antifibrotic effect of mycophenolate mofetil (MMF) and its active metabolite mycophenolic acid (MPA) were investigated. For this purpose an in vitro model for renal fibroblasts (COS-7 cells) and an animal model for progressive renal fibrosis (COL4A3-deficient mice) were examined, respectively. The in vitro experiments confirmed an inhibitory effect of MPA on fibroblast proliferation, wound closure and collagen contraction. The inhibition of cell proliferation as well as inhibition of wound closure in a wound scratch assay was completely reversible by adding guanosine/8-aminoguanosine (G/8-AG). However, in an assay for collagen matrix contraction the MPA-mediated effect could not be antagonized by G/8-AG. Until now, it is generally accepted, that the effects of MPA are solely mediated by inhibition of inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH), the key enzyme for de novo purine synthesis. These results indicate that MPA treatment in addition to an IMPDH-dependent inhibition of fibroblast proliferation and wound closure may also cause an IMPDH-independent inhibition of collagen matrix contraction. In this context, the IMPDH-independent effect could only partially be confirmed by analyzing profibrotic gene expression profiles. The effects of MPA of CTGF expression were partly IMPDH-dependent and partly IMPDH-independent. Surprisingly, the expression of CTGF was significantly decreased initially by MPA and became significantly increased later. Therefore, the results of expression of profibrotic genes are partly in line, partly contrary to the current level of knowledge. The regulation of gene expression and involved pathways in renal fibrogenesis seem to be more complex than assumed. Further studies appear to be necessary. Furthermore, the potential antifibrotic effect of MPA was examined in COL4A3-deficient mice which served as an animal model for progressive renal disease in analogy to the human Alport syndrome. 35 mice were randomly assigned and treated with 0, 10, 50, 100 or 150 mg/kg/d MMF. When somnolence was observed, indicating end-stage renal disease, the mice were sacrificed and blood and kidneys were taken. By daily administering MMF no significant elongation of live time between treated and untreated animals could be obtained (p>0.05, log-rank test). Furthermore, no correlation between MPA blood concentrations and survival time could be observed (p>0.05, Spearman rank correlation). Nevertheless, the high-dose therapy of MMF resulted in significant decreased serum creatinine and urea nitrogen concentrations as well as obviously reduced tubulointerstial fibrosis compared with placebo (p<0.05, Mann-Whitney-U test). In addition, a highly significant reciprocal correlation betw! een MPA and serum creatinine concentrations was observed (p < 0.01, Spearman rank correlation). These results indicate a potential beneficial effect of MMF on tubulointerstitial fibrosis. Further investigations are necessary to evaluate the therapeutic benefit of MMF in renal fibrogenesis.
Keywords: mycophenolate mofetil; MMF; mycophenolic acid; MPA; renal fibrosis; IMPDH
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Im Rahmen dieser Arbeit wurde das antifibrotische Potential von Mycophenolat-Mofetil (MMF) bzw. seines aktiven Metaboliten Mycophenolsäure (MPA) untersucht. Hierfür wurden einerseits ein in-vitro-Modell für renale Fibroblasten (COS-7-Zellen) und andererseits COL4A3-defiziente Mäuse als Tiermodell für eine progrediente renale Fibrose verwendet. Die in-vitro-Experimente bestätigten die inhibitorische Wirkung von MPA sowohl auf die Proliferation von Fibroblasten als auch auf ihre Funktion hinsichtlich ihrer Fähigkeit zum Wundverschluss und zur Kollagen-Kontraktion. Sowohl die Proliferationshemmung als auch die Funktionshemmung im Wundverschluss-Assay waren durch Zugabe von Guanosin/8-Aminoguanosin (G/8-AG) reversibel. In einem Kollagenmatrix-Kontraktions-Assay konnte der MPA-vermittelte Effekt jedoch nicht durch G/8-AG antagonisiert werden. Da die Wirkung von MPA bisher allein auf die Hemmung der de-novo-Synthese der Purinbasen durch Blockierung des Schlüsselenzyms Inosinmonophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) zurückgeführt wird, zeigen diese Ergebnisse erstmals neben der IMPDH-abhängigen Inhibition der Fibroblastenproliferation und des Wundverschlusses eine bisher nicht beschriebene IMPDH-unabhängige Inhibition der Kollagenmatrix-Kontraktion. Ein IMPDH-unabhängiger Effekt konnte bei der Untersuchung der Expression profibrotischer Gene jedoch nur zum Teil bestätigt werden. Die Effekte von MPA auf eine veränderte CTGF-Expression waren z.T. IMPDH-abhängig, z.T. IMPDH-unabhängig. Des Weiteren zeigten die beschriebenen Effekte eine Abhängigkeit vom zeitlichen Verlauf. So führte MPA initial zu einer supprimierten Genexpression von CTGF, später jedoch zur gesteigerten Expression. Insgesamt waren die Ergebnisse der Expression profibrotischer Gene zum Teil konform, zum anderen Teil jedoch gegensätzlich zu dem heutigen Erkenntnisstand. Es ist anzunehmen, dass die Regulierung der Genexpressionen und beteiligte Signalwege im Rahmen der Fibrogenese komplexer sind als bisher angenommen, so dass weitere Untersuchungen zur Aufklärung notwendig sind. Die antifibrotische Wirkung von MPA wurde darüber hinaus an COL4A3-defizienten Mäusen als Modell für eine rasch-progrediente Nierenfibrose untersucht. Mäuse mit homozygoter Ausprägung dieses Defektes erleiden analog zum humanen Alport-Syndrom eine progrediente Nierenfibrose, die nach etwa 70 Tagen post partum zum Versterben durch terminale Niereninsuffizienz führt. 35 Mäuse wurden randomisiert und mit 0, 10, 50, 100 oder 150 mg/kg/d MMF behandelt. Bei Somnolenz, hinweisend für ein terminales Nierenversagen, wurden die Versuchstiere geopfert und Blut und Nieren entnommen. Die tägliche Gabe von MMF bewirkte keine signifikante Verlängerung der Überlebenszeit der behandelten gegenüber den unbehandelten Versuchstieren (p>0,05, Log-Rang-Test). Ebenso ließ sich keine Korrelation zwischen den im Serum gemessenen MPA-Konzentrationen und der Überlebenszeit der Versuchstiere feststellen (p>0,05, Spearman-Rangkorrelation). Dennoch führte der hochdosierte Einsatz von MMF zu signifikant niedrigeren Kreatinin- und Harnstoff-N-Konzentrationen im Vergleich zur Placebo-Gruppe sowie zu einer deutlich abgeschwächten tubulointerstitiellen Fibrose (p<0,05, Mann-Whitney-U-Test). Weiterhin ließ sich eine hochsignifikante reziproke Korrelation zwischen den MPA-Konzentrationen und den Serum-Kreatinin-Konzentrationen feststellen (p<0,01, Spearman-Rangkorrelation). Weiterführende Untersuchungen könnten helfen, um den therapeutischen Nutzen von MMF auf die renale Fibrogenese besser bewerten zu können.
Schlagwörter: Mycophenolat-Mofetil; MMF; Mycophenolsäure; MPA; renale Fibrose; IMPDH