The Role of alpha- and beta-SNAP in Synaptic Vesicle Exocytosis
Die Rolle von alpha- und beta-SNAP bei der Exozytose Synaptischer Vesikel
by Andrea Burgalossi
Date of Examination:2008-05-13
Date of issue:2008-08-04
Advisor:Prof. Dr. Nils Brose
Referee:Prof. Dr. Tomas Pieler
Referee:Prof. Dr. Ernst A. Wimmer
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Neurotransmitter release is mediated by the neuronal SNARE proteins, which are transmembrane proteins whose assembly into ternary complexes is thought to drive membrane fusion of synaptic vesicles at axonal terminals. After fusion, spent SNARE complexes need to be disassembled in order to regenerate fusion-competent active SNAREs. This recycling step is performed by a conserved protein machinery consisting of the chaperone NSF and the co-chaperones SNAPs (alpha- and beta-SNAP, but probably not gamma-SNAP). The aim of the present study was to elucidate the functional role of alpha- and beta-SNAP in synaptic vesicle exocytosis at central synapses. The experimental approach consisted of analysing synaptic transmission in glutamatergic hippocampal neurons under conditions of decreased total alpha/beta-SNAP expression levels. I generated SNAP double mutant mice by crossing beta-SNAP deletion mutant with alpha-SNAP hypomorphic HYH mutant mice. Crossing of the two mutations resulted in a ~70% reduction of total combined alpha/beta-SNAP levels. Electrophysiological analysis of synaptic transmission showed that, while the readily releasable pool of synaptic vesicles (RRP) is only slightly smaller in SNAP double mutant neurons as compared to controls (~25% reduction), total release induced either by strong increases in intracellular Ca2+ levels or by 100 Hz stimulation trains is drastically reduced by ~60%. Detailed analysis of neurotransmitter release during stimulus trains showed that this strong reduction mainly arises from changes in the tonic release component, while the phasic release component, much like the RRP, is only slightly decreased. I propose a two-pool model to describe neurotransmitter release during high-frequency stimulation. According to this model, one pool of primed synaptic vesicles supports slow, tonic release of transmitter, while a second, the RRP, supports fast, phasic release. The two pools operate in a successive fashion with the RRP drawing vesicles from the tonically releasable pool. My study indicates that alpha and beta-SNAP are key regulators of the efficacy of central synapses. The levels of alpha- and beta-SNAP are critical in determining the size of the primed synaptic vesicle pool that supports tonic neurotransmitter release during activity trains and feeds the RRP necessary for fast phasic transmitter release.
Keywords: alpha-SNAP; beta-SNAP; SNARE; NSF; readily releasable vesicle pool
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Die Fusion synaptischer Vesikel mit der neuronalen Plasmamembran wird durch die SNARE-Proteine Synaptobrevin, Syntaxin und SNAP2-5 vermittelt. Deren Assoziation in hoch stabile, trimere Komplexe ist die treibende Kraft des Membranfusionsprozesses. Nach der Fusionsreaktion müssen verbrauchte SNARE-Komplexe wieder in ihre einzelnen Komponenten dissoziiert werden, um eine hinreichende Menge an freien, aktiven SNARE-Proteinen zu gewährleisten. Dieser Dissoziations- oder Recycling-Prozess wird durch einen evolutionär konservierten Proteinapparat bewerkstelligt, der aus dem Chaperon NSF und den Ko-Chaperonen alpha- und beta-SNAP besteht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die funktionelle Rolle von alpha- und beta-SNAP bei der Exozytose synaptischer Vesikel an Synapsen des zentralen Nervensystems zu untersuchen. Der experimentelle Ansatz konzentrierte sich dabei auf die Analyse der synaptischen Transmission in glutamatergen hippokampalen Neuronen unter Bedingungen reduzierter alpha/beta-SNAP-Expression. Ich erzeugte zunächst alpha/beta-SNAP-mutante Mäuse durch Kreuzung von beta-SNAP-Knock-Out-Mäusen mit einer Mauslinie, die eine hypomorphe alpha-SNAP-Mutation (HYH) aufweist. Homozygote Doppelmutanten exprimieren lediglich 30% der Wildtyp-Levels an alpha- undbeta-SNAP. Elektrophysiologische Analysen der synaptischen Transmission derart mutierter Nervenzellen zeigten eine leichte Verkleinerung (um 25%) des durch hypertone Sucroselösung freisetzbaren so genannten readily-releasable Pools synaptischer Vesikel. Im Gegensatz dazu wiesen alpha/beta-SNAP-mutante Nervenzellen starke Defizite (Reduktion um 60%) der synaptischen Vesikelfusion und Neurotransmission bei starker Stimulation, etwa durch starke Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration oder durch hochfrequente Aktionspotentialraten, auf. Eine detaillierte Analyse der Neurotransmission während hochfrequenter Stimulation zeigte, dass diese Defizite in alpha/beta-SNAP-mutanten Nervenzellen hauptsächlich auf eine Reduktion des tonisch freisetzbaren Vesikel-Pools zurückzuführen sind, während der phasisch freisetzbare (d.h. an Aktionspotentiale gekoppelte) Vesikelpool weniger stark beeinflusst ist. Auf der Basis dieser Befunde schlage ich ein Modell zur synaptischen Vesikelfusion während hochfrequenter Stimulation vor, dem die Annahme zweier unterschiedlicher aber voneinander abhängiger Vesikelpools zu Grunde liegt. Nach diesem Modell unterstützt ein erster Pool lediglich die langsame, tonische Freisetzung von Neurotransmitter, während ein zweiter, akut freisetzbarer readily-releasable Pool für die schnelle, phasische Transmitterfreisetzung verantwortlich ist. Die beiden Pools freisetzbarer Vesikel sind insofern voneinander abhängig, als dass Vesikel des akut freisetzbaren readily-releasable Pools aus dem tonisch freisetzbaren Pool hervorgehen. Meine Untersuchungen zeigen, dass alpha- undbeta-SNAP Schlüsselregulatoren der Effizienz zentralnervöser Synapsen sind. Ihre Level determinieren die Größe des Pools derjenigen fusionskompetenten und freisetzbaren Vesikel, die für die langsame, tonische Ausschüttung von Neurotransmittern verantwortlich sind, und die Quelle für die schnell und phasisch freisetzbaren Vesikel des readily-releasable Pools synaptischer Vesikel bilden.
Schlagwörter: alpha-SNAP; beta-SNAP; SNARE; NSF; RRP