Simulation of Fluorescence Spectroscopy Experiments

Abstract

Fluoreszenz-Spektroskopie in Kombination mit orts-spezifischer Fluoreszenzmarkierung ist mittlerweile zum Standardwerkzeug der Molekularbiologie und Biochemie zur Untersuchung der Wechselwirkungen und der konformationellen Dynamik von Biomolekülen geworden. Das Ziel dieser Arbeit war es, zur strukturellen Interpretation von Fluoreszenzanisotropie- und Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Experimenten durch Analyse und Simulation in atomarem Detail beizutragen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Ansätze entwickelt und angewandt.Im ersten Schritt wurde eine Verbesserung der Analyse von Einzelmolekül-FRET (smFRET) Experimenten angestrebt. Einzelmolekül-Techniken erfordern Methoden der Analyse die speziell der typischerweise geringen Zahl von beobachteten Ereignissen gerecht werden. Im Falle von smFRET-Experimenten besteht die Aufgabe darin Abstände und Abstandsfluktuationen von zwei Farbstoffen aus nur wenigen detektierten Photonen zu bestimmen. Daher wurde eine Maximum-Likelihood Methode zur Rekonstruktion von Abstandstrajektorien aus smFRET-Experimenten entwickelt.Im zweiten Beitrag wurde der LMLA-Algorithmus zur Berechnung krummliniger Hauotkoordinaten aus molekularen Ensembles entwickelt. Der herkömmliche Weg um wesentliche strukturelle Merkmale aus einem Ensemble, welches aus einer Molekulardynamik(MD)-Simulation gewonnen wurde, zu extrahieren, ist die Hauptkomponentenanalyse. Diese liefert allerdings nur lineare Hauptkoordinaten. In dieser Arbeit war jedoch die Rotationsbewegung eines Fluoreszenzfarbstoff von Bedeutung, welche die Bestimmung von krummlinigen Hauptkoordinaten erforderlich machte.Der dritte Beitrag beschäftigte sich mit der MD-Simulation von Fluoreszenzanisotropie-Experimenten. Um zu untersuchen, wie Informationen über die Proteindynamik aus der Fluoreszenzanisotropie eines gebundenen Farbstoffs erhalten werden können, wurden MD-Simulationen eines Alexa488 Farbstoffs, der kovalent an die AB-Schleife von Bacteriorhodopsin gebunden ist, durchgeführt. Die von der Simulation vorhergesagte Fluoreszenzanisotropie stimmt gut mit den experimentellen Ergebnissen überein. Die Analyse der Korrelation zwischen Farbstoff- und Proteinbewegung liefert eine atomistische Beschreibung des Teils des Proteins, dessen Bewegung im Experiment beobachtet wird. Durch den Vergleich mit zusätzlichen Simulationen ohne den Farbstoff, konnte die im Experiment notwendige Annahme, dass der Farbstoff keinen wesentlichen Einfluss auf die Proteindynamik hat, getestet werden. In der Tat konnte nur eine kleine Abweichung der Schleifenflexibilität beobachtet werden, welches eine solide theoretische Grundlage für die herkömmliche Interpretation der Messungen liefert.