Tuning DNA Compaction

Abstract

DNA-Kompaktion bezeichnet die Kondensation von langen DNA-Molekülen zu extrem dicht gepackten Aggregaten mit komplexer Nanostruktur. Induziert wird dieser Vorgang im Allgemeinen durch kationische Wechselwirkungspartner. Trotz der bereits erzielten großen Fortschritte auf dem Weg zu einem vollständigen Verständnis der zugrundeliegenden Wechselwirkungsmechanismen stellt das komplexe Wechselspiel der zahlreichen beteiligten Reaktionspartnern Wissenschafter noch immer vor eine Vielzahl unbeantworteter Fragen. Insbesondere der hierarchische Aufbau des Chromatins, bei dem die DNA zunächst auf Histon-Oktamere aufwickelt und anschließend unter Beteiligung von Linker-Histonen zu höheren Organisationsstufen überführt wird, ist weitgehend ungeklärt.In der vorliegenden Arbeit werden biomimetische Untersuchungen des denkbar einfachsten Modellsystems für die DNA-Kompaktion vorgestellt. Dieses besteht nur aus Dendrimeren, die als gleichmäßig geladene, bis zu 10nm große, kationische Kugeln beschrieben werden können, und polydispersen DNA-Molekülen mit einer unspezifischen Basensequenz. Zur Untersuchung werden Röntgen-Diffraktionsmessungen eingesetzt. Die Durchführung der Messungen im kontinuierlichen Fluss in Mikrofluidik-Bauteilen unter Ausnutzung hydrodynamischer Fokussierungseffekte gewährt einen kontrollierten und zeitaufgelösten Zugang zu verschiedenen Stadien des Selbstorganisationsprozesses. Dadurch können insbesondere transiente Zwischenstadien der Reaktion verfolgt und ein quantitatives Verständnis der Kompaktionsmechanismen erzielt werden. Der hohe Grad der Kontrolle über die Größe und die Ladung der Dendrimere ermöglicht es, verschiedene DNA-Kompaktionsszenarien gezielt einzustellen und im Detail zu analysieren.Die Vielfalt der natürlich vorkommenden DNA-Kompaktionspartnern reicht von kleinen organischen Kationen wie Spermidin und Spermin in Viren bis hin zu den wesentlich größeren Histon-Oktameren in eukaryotischen Zellen. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass sich Dendrimere ausgesprochen gut dazu eignen, dieses gesamte Spektrum zu reproduzieren. Trotz seiner starken Vereinfachung ist das Dendrimer/DNA-Modellsystem in der Lage, charakteristische Züge der natürlich auftretenden DNA-Kompaktion wiederzugeben. Besonders hervorzuheben ist dabei die Wechselwirkung von DNA mit PAMAM 6-Dendrimeren, die zu einem Aufwickeln der DNA um die in Bezug auf Ladung und Größe mit Histon-Oktameren vergleichbaren PAMAM 6 führt. Die gebildeten PAMAM 6/DNA-Einheiten zeigen eine erstaunliche Übereinstimmung in Größe und Gestalt mit nukleosomalen Kernpartikeln. Für Dendrimere mit einer mittleren Größe von ca. 3nm kann unter Verwendung von mikrofluidischen Methoden ein neuartiger DNA-Kompaktionsmechanismus unterhalb des isoelektrischen Punktes beobachtet werden. Dieser unterscheidet sich grundlegend von den bereits bekannten Salz- oder Makroion-induzierten DNA-Kondensationsformen.Neben den Untersuchungen zur DNA-Kompaktion ist die Abhängigkeit der Dendrimerkonformation von der Ladung der Moleküle experimentell genau quantifiziert worden. Dabei sind vorhersagbare, ladungsabhängige Änderungen der Dendrimerkonformation beobachtet worden. Diese Beobachtungen beseitigen die Diskrepanz, die bisher in der Literatur zwischen theoretischen Vorhersagen und experimentellen Beobachtungen bestand.Zusätzlich zu den künstlichen Modell-Proteinen wurde auch die Wechselwirkung von natürlich vorkommenden Linker-Histonen H1 mit DNA im Mikrofluss zeitaufgelöst untersucht. Die aufgezeichnete Röntgen-Streubilder belegen einen zweistufigen Wechselwirkungsmechanismus: Auf ein zunächst unspezifisches Anlagern der Proteine an die DNS folgt eine Reorganisation der Moleküle im gebildeten Komplex. Die erzielten Ergebnisse legen nahe, dass eine durch die DNA induzierte vollständige Faltung der endständigen H1-Proteinketten für den beobachteten Phasenübergang der H1/DNA-Komplexe verantwortlich ist.Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse leisten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des hierarchischen Aufbaus von Chromatin. Es ist davon auszugehen, dass die zugrundeliegenden Konzepte einen experimentellen Zugang zu weiteren relevanten Protein/DNA-Systeme gewähren werden. Darüber hinaus besitzen die hier untersuchten Systeme biotechnologische Bedeutung und es wird erwartet, dass sie zur Entwicklung zukünftiger Transfektionsvektoren beitragen werden.