Fluorescence nanoscopy in three dimensions
Fluoreszenz-Nanoskopie in drei Dimensionen
by Claudia Geisler
Date of Examination:2009-12-15
Date of issue:2010-03-11
Advisor:Prof. Dr. Alexander Egner
Referee:Prof. Dr. Rainer G. Ulbrich
Referee:Prof. Dr. Stefan Hell
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-2644
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Description:Dissertation
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Abstract
English
Live-cell microscopy faces two challenges when neither the spatial nor the temporal information about the specimen should be lost. First, the microscope must be able to resolve the smallest structure to be investigated and, second, the imaging speed must be at least on the time-scale of the ongoing dynamics. This thesis expands two superresolution concepts, namely 4Pi and single marker switching (SMS) microscopy, and addresses both problems. A fast and signal-efficient 4Pi multifocal multiphoton microscope is introduced which combines an unprecedented frame acquisition of up to the video rate (25 Hz) with a 6-fold improvement in the axial resolution compared to two-photon microscopy. This work further establishes a novel imaging protocol for SMS microscopy, which cuts down the recording times 100-fold to 2-2.5 minutes compared to previous implementations and enables two-dimensional imaging in the interior of intact cells. By additionally employing two offset detection channels for the axial marker position estimation, three-dimensional (3D) SMS imaging of a volume of up to 1.2 μm in depth is rendered possible with high linearity and without any need for axial scanning. The positioning accuracy for the marker from which ca. 1600 photons are detected is 16-fold (laterally) and 12-fold (axially) better than the resolution of a conventional confocal microscope. The potential of both concepts for the life sciences is demonstrated by imaging 3D structures in living cells and analyzing their spatial changes with time.
Keywords: microscopy; high resolution; 4Pi; PALM; SMS; photoswitching
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Die mikroskopische Untersuchung von Prozessen auf der submikrometer Skala birgt zwei grundsätzliche Herausforderungen, wenn weder räumliche noch zeitliche Informationen über die Probe verloren gehen sollen. Zum einen muss das Auflösungsvermögen des Mikroskops besser als die kleinste zu untersuchende Struktur sein und zum anderen muss die Aufnahmegeschwindigkeit in der Größenordnung der ablaufenden Prozesse liegen. Diese Arbeit behandelt zwei hochauflösende Fernfeld-Mikroskopieverfahren, namentlich 4Pi-Mikroskopie und Einzelmolekülschaltmikroskopie (englisch: single marker switching, SMS), unter Berücksichtigung dieser beiden Aspekte. Zunächst wird ein schnelles und signaleffizientes multifokales Multiphotonen-4Pi-Mikroskop vorgestellt, welches eine bisher beispiellose Bildaufnahmerate von bis zu 25 Hz mit einer im Vergleich zur Zweiphotonenmikroskopie sechsfach höheren axialen Auflösung verbindet. Des Weiteren wird ein neues SMS-Mikroskop vorgestellt, welches die Aufnahmezeit um einen Faktor 100 auf 2-2,5 Minuten verkürzt und erstmals eine zweidimensionale Bildgebung innerhalb intakter Zellen ermöglicht. Die zusätzliche Erweiterung auf zwei versetzte Detektionskanäle zur Bestimmung der axialen Markerposition erlaubt zudem eine dreidimensionale Bildgebung in einem Volumen von bis zu 1,2 μm Tiefe mit hoher Linearität und ohne dass die Probe in axialer Richtung gescannt werden muss. Die Positionsbestimmung eines Markers, von dem ca. 1600 Photonen detektiert werden, ist lateral 16-fach und axial 12-fach besser als die Auflösung eines herkömmlichen Konfokalmikroskops. Anhand von Aufnahmen dreidimensionaler Strukturen innerhalb lebender Zellen sowie der Analyse ihrer zeitlichen Veränderung wird das Potential, welches beide Mikroskopieverfahren für die Lebenswissenschaften bieten, verdeutlicht.
Schlagwörter: Mikroskopie; Hochauflösung; 4Pi; PALM; SMS; photoschalten