Quantitation Strategies in Optically Sectioning Fluorescence Microscopy

Abstract

Die Entwicklung von Mikroskopen, die innerhalb eines Experiments Fluoreszenzintensitäten in mehr als fünf Dimensionen aufnehmen können (z. B. Raum, Zeit und Farbe), ermöglicht das Messen von Parametern, die zuvor nicht zugänglich waren. Viele weitere experimentelle Fragestellungen ergeben sich durch die Untersuchung der Korrelationen zwischen diesen Dimensionen. Das Ziel moderner Mikroskopie ist die Extraktion quantitativer Informationen aus bestimmten Korrelationen. Beispielsweise nutzt man in der sog. Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleichung (fluorescence revovery after photobleaching, FRAP) die Korrelation zwischen Zeit und Raum zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten. Im FÖRSTER-Resonanzenergietransfer werden Raum und Farbe zur Bestimmung von molekularen Wechselwirkungen und Konzentrationen miteinander korreliert. Die bildgebenden Systeme müssen sorgfältig kalibriert werden, damit die Korrelationen, die in derartigen Experimenten untersucht werden, die zugrunde liegenden Mechanismen wiederspiegeln. Andernfalls analysiert man Artefakte, die zu falschen Schlüssen (ver-)leiten, und eine Quantifizierung der Parameter erweist sich als unmöglich. Der erste Teil dieser Dissertation hat zum Ziel, die Quantifizierung und Optimierung in der optisch schnittbildenden Mikroskopie zu vereinfachen. Zu diesem Zweck wurde das neue Werkzeug zur Beurteilung der Bildqualität schnittbildender Mikroskope, das sog. sectioned image property chart (SIPchart), fundamental bearbeitet, so dass man ein erweitertes SIPchart (eSIPchart) erhält. SIPcharts erhält man durch die Analyse eines axialen Bildstapels einer extrem dünnen (kleiner 100 nm), gleichförmigen fluoreszierenden Schicht. Durch die pixelweise Modellierung der axialen Intensitätsverteilungen erhält man Parameter-Karten, die eine bestimmte Abbildungseigenschaft im Bildfeld beschreiben, wie zum Beispiel ortsabhängige Intensitätsschwankungen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die eSIPchart-Routine zur Analyse axialer Bildstapel von fluoreszierenden Lösungen entwickelt. In dieser werden folgende Erweiterungen eingeführt: Auf der Grundlage statistischer Analyse werden "zufällige Detektoreinheiten" in die Anzahl detektierter Photonen umgerechnet. Dies ermöglicht die Beurteilung der Qualität der Modellfunktion über eine Karte des reduzierten chi^2-Parameters. Weiterhin kann man nun Konzentrations-Kalibrations-Kurven aufnehmen. Die neu eingeführte VOIGT-Funktion liefert einen Wichtungsfaktor, aufgrund dessen die Ausleuchtung der Rückapertur abgeschätzt werden kann. Der Schritt von dünnen Schichten zu fluoreszierenden Lösungen ist aus verschiedenen Gründen von Vorteil: i) Für Kalibration und Experiment kann derselbe Farbstoff verwendet werden. Somit werden Kalibrationsfehler vermieden, die durch ein unterschiedliches Fluoreszenzspektrum oder einen Brechungsindexunterschied des Testpräparates, wie es eine dünne Schicht darstellt, zustande kommen. ii) Fluoreszenzfarbstoffe sind in jedem Labor vorhanden, in dem Fluoreszenzmikroskopie betrieben wird. Sie sind leicht zu erwerben, billig und vielseitig. iii) Eine fluoreszierende Lösung kann mehrere Farbstoffe enthalten, die somit ein großes Fluoreszenzspektrum abdecken. iv) Der Brechungsindex des Lösungsmittels kann auf den Brechungsindex des Immersionsmediums eingestellt werden. Die eSIPchart-Analyse ermöglicht eine präzise Charakterisierung der sphärischen und chromatischen Aberrationen sowie eine Optimierung der Einstellung des Korrekturringes qualitativ hochwertiger Mikroskopobjektive. Abschließend werden die Charakteristika einer bestimmten Mikroskopkonfiguration im eSIPchart übersichtlich zusammengestellt. Das ermöglicht die schnelle Beurteilung der Abbildungseigenschaften sowie der Eignung eines optisch schnittbildenden Mikroskops für ein geplantes Experiment. Der zweite Teil der Dissertation behandelt die Anwendung einer Reihe neu entwickelter Vergleichsmethoden zum Vergleich von drei Mikroskopsystemen. Das ApoTome nutzt zur optischen Schnittbildung strukturierte Beleuchtung durch ein lineares Gitter. Dieses wird einem konfokalen Laser-Raster-Mikroskop (cLSM) und konventioneller Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie gegenübergestellt. Verschiedene Abbildungsparameter werden durch verschiedene Methoden bestimmt: Die axiale sowie die laterale Auflösung werden mit fluoreszierenden Kügelchen und dünnen fluoreszierenden Schichten bestimmt. Die Ortsabhängigkeit verschiedener Parameter wird durch eSIPcharts ermittelt. Die Auflösungsanisotropie wird mittels linear gewachsener Dendriten ermittelt. Diese stammen aus Zellkulturen aus dem Riechhirn der Kaulquappe des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. Das Abbildungsverhalten für tief im Gewebe liegende Strukturen wird vermittels mikroinjizierter Mitralzellen aus dem Riechhirn des Krallenfrosches untersucht. Das ApoTome erreicht unter Standardbedingungen, d. h. mit einem Durchmesser der konfokalen Lochblende von 1 A.U. und dem ApoTome-Gitter "VH", eine bessere laterale Auflösung als das cLSM. Das kommt dadurch zustande, dass die Rückapertur im ApoTome homogen ausgeleuchtet wird, während sie im cLSM die (abgeschnittene) GAUSS"sche Intensitätsverteilung des Anregungslasers aufweist. Die axiale Auflösung ist im cLSM mit einer Ausnahme besser als im ApoTome: Dieses übertrifft das cLSM bei der Auflösung niedriger Raumfrequenzen unter Verwendung von Aufnahmeparametern, die auf optimale Auflösung abzielen (cLSM Lochblende = 0.4 A.U. sowie ApoTome, "VL"-Gitter). Im cLSM zeigt die axiale Auflösung eine zentral-symmetrische Verteilung über das Bildfeld, welche hauptsächlich durch Aberrationen entstehen, die mit dem Rasterverfahren zusammen hängen. Demgegenüber ist die axiale Auflösung des ApoTomes homogen innerhalb des Bildfeldes. Die Mikroskopiemethode der strukturierten Beleuchtung mit einem linearen Gitter weist anisotrope Auflösung auf: Lineare Strukturen unterhalb der Auflösungsgrenze werden schlechter aufgelöst, wenn sie die gleiche Orientierung wie das Gitter aufweisen. Im Falle ähnlicher Raumfrequenzen wie das Gitter werden sie kontrastreicher dargestellt. Bezogen auf die optische Schnittbildung ist die untersuchte Form der strukturierten Beleuchtung eingeschränkt auf dünne Präparate, da das POISSON-Rauschen aus den Außerfokusebenen nicht herausgerechnet werden kann. Weiterhin muss das Präparat wenigstens für einige Sekunden stabil sein, da die Aufnahme der Rohdaten für ein einzelnes optisch geschnittenes Bild etwa eine Sekunde dauert.