Functional Analysis of Heat Shock Protein HSPA4

Abstract

Die Ziele dieser Arbeit waren, die Gründe für die männliche Infertilität, das verringerte Größenwachstum und die kardiale Hypertrophie, die in Hspa4-/- Mäusen vorliegen, zu untersuchen.Um das spermatogoniale Stadium zu identifizieren, in dem die Spermatogenese in Hspa4-defizienten Mäusen mit C57BL/6J x 129/Sv hybridem genetischem Hintergrund betroffen ist, führten wir histologische und immunologische Analysen durch. Untersuchungen der Keimzellentwicklung in juvenilen Hspa4-/- Mäusen zeigten einen Arrest der ersten Spermatogenesewelle in der späten Prophase I. Auf RNA-Ebene konnte eine deutliche Verminderung der Expression später meiotischer und postmeiotischer Markergene detektiert werden, wohingegen die Expression früher meiotischer Gene in Hspa4-/- Testes nicht verändert war. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass HSPA4 für die Regulierung diverser Chaperon-vermittelter Prozesse und des Zellzyklus während der Keimzellentwicklung benötigt wird.Das zweite Ziel dieser Arbeit war es, den Grund für das verringerte Größenwachstum in Hspa4-defizienten Mäusen im inbred 129/Sv genetischen Hintergrund zu untersuchen. Um herauszufinden, ob das verringerte Größenwachstum an einer Myopathie der Skelettmuskeln liegt, wurden verschiedene histologische Analysen verschiedener Skelettmuskeln durchgeführt. Diese Analysen zeigten, dass die Muskeln Tibialis anterior, Vastus intermedius, Soleus und die paraspinale Muskulatur in adulten Hspa4-/- Mäusen myopathische Veränderungen aufwiesen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass diese myopathischen Veränderungen bereits im frühen postnatalen Entwicklungsstadium der Hspa4-/- Mäuse vorlagen. Dies ließ vermuten, dass die Myopathie der Skelettmuskeln der Grund für das verringerte Größenwachstum ist. Außerdem lassen diese Ergebnisse vermuten, dass HSPA4 einen Effekt ausübt, der die Skelettmuskulatur vor mechanischem oder metabolischem Stress schützt, der sonst die Degradierung der Skel! ettmuskulatur auslöst.Um herauszufinden, ob diese Myopathie der Skelettmuskulatur auch im Herzen als hypertrophe Kardiomyopathie vorliegt, wurden histologische Analysen und zwei-dimensionale Echokardiogramme durchgeführt. Die histologischen Analysen zeigten die Entwicklung der kardialen Hypertrophie und von Fibrose im Herzen der Hspa4-defizienten Mäuse. Ultrastrukturanalysen zeigten einen Abbau der Myofibrillen in Kardiomyocyten und eine gesteigerte Annsammlung von Collagen (Fibrose) im Herzen der Hspa4-defizienten Mäuse. Echokardiogramme bestätigten die kardiale Hypertrophie bei Hspa4-/- Mäusen. Um herauszufinden, zu welchem Zeitpunkt die Entwicklung der kardialen Hypertrophie und der Fibrose in Hspa4-/- Herzen beginnt, wurde die Expression von Hypertrophie- und Fibrose-Markergenen im Herzen verschiedener postnataler Stadien mittels Northern Blot und RealTime-PCR untersucht. Diese Analysen zeigten, dass die Entwicklung der kardialen Hypertrophie und der Fibrose in Hspa4-/- Mäusen in frühen postnatalen Stadien beginnt. Wir vermuten, dass die frühe postnatale Letalität bei Hspa4-/- Mäusen im inbred 129/SV genetischen Hintergrund durch das Fortschreiten der Myopathie der Skelettmuskulatur und die hypertrophe Kardiomyopathie erklärt werden kann. Im Gegensatz zum Skelettmuskel- und Herzphänotyp bei Hspa4-/- Mäusen mit inbred Hintergrund zeigten histologische Untersuchungen und Expressionsanalysen hypertropher Gene, dass die kardiale Hypertrophie in Hspa4-defizienten Mäusen mit C57BL/6J x 129/Sv hybridem genetischem Hintergrund nicht ausgeprägt ist. Um die Signalwege zu identifizieren, die die kardiale Hypertrophie in Hspa4-/- Mäusen vermitteln, untersuchten wir in Herzen von Wildtyp-Mäusen und von Hspa4-/- Mäusen die Expression einiger Gene und Proteine, die am Gp130/STAT3-, MAPK- und Calcineurin-NFAT-Signalweg beteiligt sind. Diese Analysen ließen vermuten, dass die Stat3- und MAPK-Signalwege nicht für die Entwicklung der kardialen Hypertrophie in Hspa4-/- Mäusen verantwortlich sind. Im Gegensatz dazu scheint eine erhöhte Aktivität des Calcineurin-NFAT-Signalwegs die kardiale Hypertrophie zu modulieren. Microarray-Analysen wurden verwendet, um die Genexpression im Herzen der Hspa4-defizienten Mäuse im Alter von 25 Tagen mit denen von Wildtyp-Mäusen zu vergleichen. 98 Gene wurden identifiziert, die unterschiedlich exprimiert waren. Einige Gene wurden ausgewählt und anhand ihrer Funktion in der Entwicklung der kardialen Hypertrophie klassifiziert. Um die Ergebnisse der Microarray-Analysen zu bestätigen, wurden quantitative RealTime-PCRs durchgeführt. Wir konnten bestätigen, dass Gene, die in der Ionenkanal-vermittelten Signalweiterleitung (Kcne1, Kcnd2, Scn4a, Hcn1 and Irx4), im Schutz der Zellen vor oxidativem Stress (Gnao1, Ptp4a1 and Mme1) oder in der Induktion von oxidativem Stress (Maob) involviert sind, unterschiedlich exprimiert werden. Diese veränderte Expression kann an der Entwicklung der kardialen Hypertrophie in Hspa4-/- Mäusen beteiligt sein.