Functional analysis of mitochondrial sirtuins in C. elegans and mammalian cells

Abstract

Silent Information Regulator 2 (SIR-2) Proteine, die auch als Sirtuine bezeichnet werden, gehören zu einer hoch konservierten Proteinfamilie NAD+-abhängiger Protein Deacetylasen. Sirtuine haben sich als wichtige Energiesensoren und Regulationsfaktoren von metabolischen, Stressresistenz- und Alterungsprozessen herausgestellt. In Säugetieren ist diese Proteinfamilie sehr komplex und umfasst sieben Varianten (SIRT1 bis SIRT7) mit unterschiedlicher subzellulärer Lokalisierung (Nukleus, Zytoplasma und Mitochondrien). Das mitochondriale Protein SIRT4 ist im Moment das einzig verbleibende mammalia Sirtuin für das eine ADP-Ribosyltransferase- aber keine NAD+-abhängige Deacetylasefunktion nachgewiesen werden konnte. SIRT4 ist ein negativer Regulator von Insulinsekretion und könnte einen neuen therapeutischen Angriffspunkt zur Behandlung von Diabetes darstellen. Dies erfordert jedoch ein besseres Verständnis der Biologie und enzymatischen Funktion, sowie die Identifizierung von neuen SIRT4 Substraten. Der einfache, multi-zelluläre Organismus C. elegans besitzt nur vier SIR-2 Varianten (SIR-2.1 bis SIR-2.4), die alle eine hohe Sequenzkonservierung zu den mammalia Sirtuinen aufweisen. Überexpression von SIR-2.1 erweitert die Lebensdauer von C. elegans, was zeigt, dass auch diese C. elegans Proteine eine interessante Rolle in der Regulierung der Lebensdauer und der Koppelung von Metabolismus mit Prozessen des Alterns spielen. Während sich der Grossteil bisheriger Studien auf die Funktion von SIR-2.1 konzentriert, sind die SIRT4 homologen Varianten SIR-2.2 und SIR-2.3 kaum charakterisiert. In dieser Doktorarbeit habe ich gezeigt, dass SIR-2.2 und SIR-2.3 auch in Mitochondrien lokalisert sind und in C. elegans überwiegend in Gewebe mit hohem Energiebedarf, wie z.B. Pharynx und Muskeln der Leibeswand, exprimiert werden. Unter Standardwachstumsbedingungen verursachen Deletionsmutationen in den Genen von sir-2.2 und sir-2.3 keinen offensichtlichen Phänotyp in Würmern. Allerdings führte Überexpression und Verlust von SIR-2.2 und SIR-2.3 zu erhöhter Sensitivität gegenüber oxidativem Stress, was darauf hinweist, dass beide Proteine in Reaktionswegen zur Abwehr von oxidativem Stress fungieren. Mit Hilfe von Immunpräzipitation und Massenspektrometrie konnte ich die drei mitochondrialen Vertreter der biotin-abhängigen Carboxylasen, nämlich Pyruvatcarboxylase (PC), Propionyl-CoA-Carboxylase (PCC) und Methylcrotonyl-CoA-Carboxylase (MCC), als Interaktionspartner von SIR-2.2 und SIR-2.3 identifizieren. Die Interaktion war evolutionär konserviert für mammalia SIRT4 und wurde durch die homologe Biotincarboxylase Domäne vermittelt, die in allen drei Proteinen vorhanden ist. Mitochondriale Biotin-Carboxylasen spielen eine bedeutende Rolle in Gluconeogenese, Aminosäure-Katabolismus, β-Oxidation und Ketonkörperbildung. Da in allen drei Proteinen multiple Lysin-Acetylierungen gefunden wurden, wird ihre enzymatische Aktivität möglicherweise durch NAD+-abhängige Deacetylierung, die durch mammalia SIRT4 und C. elegans SIR-2.2 und SIR-2.3 vermittelt wird, reguliert. SIRT4, SIR-2.2 und SIR-2.3 besaßen keine NAD+-abhängige Deacetylase Aktivität bei Peptiden von PC, die die konservierten und acetylierten Lysine K273 und K741 enthielten. Jedoch reduzierte die Überexpression von SIRT4 spezifisch die Acetylierungslevel der α-Untereinheiten von PCC und MCC, wodurch zum ersten mal gezeigt wurde, dass SIRT4 in der Tat eine NAD+-abhängige Deacetylase ist. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass C. elegans SIR-2.2 und SIR-2.3 sowie mammalia SIRT4 konservierte Funktionen haben. Ihre Interaktion mit mitochondrialen Biotin-Carboxylasen weist auf eine wichtige Rolle als Energiesensoren und Regulationsfaktoren bei der Anpassung des Stoffwechsels auf Nährstoffmangel hin.