The importance of charged amino acids in the human Organic Anion Transporter 1

Abstract

Der organische-Anionen-Transporter 1 (OAT1) ist für die renale Ausscheidung organischer Anionen von großer Bedeutung. Dennoch ist gegenwärtig wenig über Struktur-Wirkungsbeziehungen und über die Bindung und Translokation von Substraten bekannt. In dieser Arbeit wurden konservierte, positive geladene Aminosäurereste des OAT1 untersucht, die etwas mit Substratbindung und transport zu tun haben könnten. Außerdem wurden der Einfluss des pH-Wertes und des Chlorids auf die Transportaktivität des OAT1 sowie seine Wechselwirkung mit Zitratzyklusderivaten untersucht. Die Carboxyfluorescein-Aufnahme in HEK293-Zellen, die den humanen OAT1 stabil exprimierten, wurde durch alpha-Ketoglutarat > Succinat > Zitrat > Malat im Medium gehemmt. Die Entfernung von Chlorid aus dem Medium hemmte die Aktivität des OAT1 deutlich, während eine Ansäuerung von pH 7,4 auf 6,0 den Transport von radioaktiv markiertem p-Aminohippurat (PAH) und Glutarat signifikant stimulierte. Durch gerichtete Mutagenese wurden diverse geladene Aminosäurereste ersetzt und die Mutanten funktionell charakterisiert. Der Ersatz des Arginins an Position 446 in der 11. Transmembrandomäne durch das ebenfalls positiv geladene Lysin (R466K) führte zu einer starken Reduktion der PAH-Aufnahme bei unveränderter Proteinexpression in der Membran von Xenopus laevis Oozyten. Die PAH-Aufnahme wurde durch extrazelluläres Glutarat gehemmt und durch intrazelluläres Glutarat stimuliert, was auf eine unveränderte Interaktion der R466K-Mutante mit Dikarboxylaten hindeutet. Wenn aber das Arginin durch das negativ geladene Aspartat (R466D) ausgetauscht wurde, war die Wechselwirkung mit Glutarat aufgehoben. Im Gegensatz zum Wildtyp-OAT1 wurde die PAH-Aufnahme durch die R466K-Mutante nicht mehr durch Chlorid stimuliert. Auch der Transport von markiertem Glutarat und Ochratoxin war beim Wildtyp, nicht aber bei der R466K-Mutante chloridabhängig. Untersuchungen zur Transportkinetik ergaben, dass Chlorid beim Wildtyp-OA T1 die Vmax erhöht, die Affinität (Km) aber unbeeinflusst lässt. Die R466K-Mutante zeigte eine reduzierte Vmax bei gegenüber dem Wildtyp unveränderter Km für PAH. Wir schließen aus den Befunden, dass das Arginin 466 mit Chlorid interagiert und für den PAH-Translokationsschritt von Bedeutung ist.