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Mechanism of pFGE and FGE Retention in Endoplasmic Reticulum

Mechanismus der retention von pFGE und FGE im Endoplasmatischen Reticulum

von Santosh Lakshmi Gande
Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2007-01-16
Erschienen:2007-03-05
Betreuer:Prof. Dr. Dr. h.c. Kurt von Figura
Gutachter:Prof. Dr. Dr. h.c. Kurt von Figura
Gutachter:Prof. Dr. Ralf Ficner
Zum Verlinken/Zitieren: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B61D-3

 

 

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Name:gande.pdf
Size:3.32Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Zusammenfassung

Englisch

The formylglycine generating enzyme FGE, encoded by SUMF1 gene (Sulfatase modifying factor 1) performs a novel co-translational modification of a specific cysteine residue to formylglycine in sulfatases. Mutations in the gene encoding FGE is the causes for multiple sulfatase deficiency disease in which the activity of all sulfatases is severely lowered. In the human genome, another gene that shares high sequence homology to FGE has been identified. It is designated as SUMF2 and the protein as paralog of FGE, pFGE, whose function is still ill- defined. Topological distribution of these proteins revealed them as ER(Endoplasmic reticulum)-resident proteins but in most species they lack the conventional ER retention signals. This study was focused on identifying the retention mechanism of pFGE and FGE. We have found that retention of pFGE occurs by a saturable mechanism and the presence of a C-terminal tag hinders the retention of pFGE. This observation led us to identify PGEL tetrapeptide as the putative C-terminal determinant of pFGE and truncation of PGEL lowers the retention of pFGE significantly. Further we found that PGEL when tagged to C-terminus of lysozyme, a secretory protein, could be retained, suggesting that PGEL is an autonomous retention signal sequence.FGE retention in ER is carried out by a saturable mechanism but it has no C-terminal determinant that could govern its localization to ER. Its high sequence homology, localization, and structural similarities to pFGE led us to study whether their interaction could be the means for the retention of FGE in the ER. Although, by yeast two-hybrid assay we found that pFGE interacts with FGE, it showed no influence on FGE retention. Biochemical approaches for identifying interacting proteins of FGE that may suggest for its retention were unsuccessful in obtaining appropriate candidate proteins. Finally we checked the amino terminus of FGE and we found that amino-terminal truncation of 34-69 residues in FGE lowers its retention and in vivo biological activity without effecting its in vitro catalytic activity significantly, suggesting that the amino-terminus of FGE might have some role in mediating its retention.In summary pFGE retention is mediated by its C-terminal tetrapeptide PGEL, which is necessary and sufficient to mediate retention in ER. While, FGE retention could be mediated by its amino-terminus residues.
Keywords: Endoplasmic reticulum; protein retention; KDEL; formylglycine generating enzyme FGE; paralog of FGE; Sulfatases.

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Das Formylglycin bildende Enzym FGE, codiert durch das Gen SUMF1 (Sulfatase modifying factor1), verursacht in Sulfatasen eine neuartige co-translationale Modifikation eines spezifischen Cysteinrestes zu Formylglycin. Mutationen im FGE-codierenden Gen sind die Ursache der Multiplen Sulfatase- Defizienz, bei welcher die enzymatischen Aktivitäten sämtlicher Sulfatasen drastisch reduziert sind. Im humanen Genom wurde ein weiteres Gen identifiziert, welches eine starke Sequenzhomlogie zu FGE aufweist. Es wird als SUMF2 und das Protein als paraloges FGE (pFGE) bezeichnet, wobei die genaue Funktion dieses Proteins noch immer unbekannt ist. Die topologische Verteilung beider Proteine lässt auf eine ER(Endoplasmatischen Reticulum)-Lokalisation schließen, wobei ihnen in den meisten Spezies jedoch ein klassisches ER-Retentionssignal fehlt. Die vorliegende Studie konzentrierte sich auf die Identifikation des ER-Retentionsmechanismus von pFGE und FGE. Es konnte gezeigt werden, dass der Retentionsmechanimus von pFGE ein sättigbarer Prozess ist, bei welchem durch die Gegenwart eines C-terminalen Tags die Retention des Proteins behindert werden konnte. Weitergehende Untersuchungen führten zur Identifikation des Tetrapeptides PGEL als mutmaßliche C-terminale Determinate für die Retention von pFGE. Die Trunkierung der Sequenz PGEL führte zu einer drastisch verminderten Retention von pFGE. Das Einfügen der PGEL-Sequenz an den C-terminalen Teil des Enzyms Lysozym führte zu einer Retention des normalerweise sekretierten Porteins. Diese Beobachtungen zeigen, dass es sich bei PGEL um eine autonome Retentionssignal-Sequenz handelt.Die Retention von FGE im ER ist ebenfalls ein sättigbarer Mechanismus, allerdings besitzt FGE keine C-terminale Determinante, welche die Lokalisation im ER bestimmen könnte. Die starke Sequenzhomologie, die Lokalisation und die strukturellen Ähnlichkeiten zu pFGE führten zu weitergehenden Studien über eine mögliche Interaktion beider Proteine, durch die dann die ER-Retention von FGE vermittelt werden könnte. Obwohl Yeast-two-hybride-Tests eine Interaktion zwischen pFGE und FGE zeigten, konnte kein Einfluss auf die Retention von FGE festgestellt werden. Weiterführende biochemische Untersuchungen zur Indentifikation möglicher Interaktionsparter, die eine Retention von FGE im ER vermitteln könnten, lieferten keine adäquaten Kandidatenproteine. Schließlich wurde der aminoterminale Teil von FGE genauer untersucht. Hierbei konnte eine drastische Verminderung der Retention und der biologischen Aktivität (ohne dabei die katalytische in vitro-Aktivität signifikant zu beeinflussen) festgestellt werden, wenn die FGE-Aminosäurereste 34-69 trunkiert wurden. Diese Beobachtungen lassen darauf schließen dass der aminoterminale Teil von FGE eine Rolle bei der Vermittlung der ER-Retention von FGE spielt.Zusammenfassend kann man sagen, dass die Retention von pFGE durch sein C-terminales Tetrapeptid PGEL vermittelt wird, welches notwendig und ausreichend ist für die Retention im ER. Die Retention des FGE Retention dagegen wird durch den aminoterminalen Teil des FGE-Proteins vermittelt.
Schlagwörter: Endoplasmatischen Reticulum; Protein Retention; KDEL; Formylglycin bildende Enzym FGE; paraloges FGE; Sulfatasen.
 

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