Determination of the Structure of the Spliceosomal U6 snRNP from Yeast, <i>Saccharomyces cerevisiae</i>

Abstract

Die U6 small nuclear RNA (snRNA) durchläuft im Verlauf des prä-mRNA Spleißens und des Spliceosome-assembly wichtige katalytische Konformationsänderungen. Sie assoziiert mit dem spezifischen Protein Prp24, und einem Proteinkomplex bestehend aus sieben LSm Proteinen, welche dann das U6 small nuclear ribonucleoprotein (U6 snRNP) formen. Diese Proteine wurden als RNA chaperones beschrieben, welche die Bindung der U6 snRNA mit U4 snRNA stimulieren. Sowohl der genaue Mechanismus, wie das Prp24 Protein und der LSm-Komplex die U4/U6 Verbindung fördern, als auch die Bindestellen des Prp24 Proteins in dem U6 snRNP sind jedoch nicht bekannt. Um die Bindestellen des Prp24 Proteins und der LSm Proteine an der U6 snRNA, sowie den Mechanismus der U4/U6 Assoziation zu verstehen, wurden die aufgereinigten nativen U6 snRNP Partikel mit chemical structure probing, UV-crosslinking und hydroxyl radical footprinting charakterisiert. Die drei Methoden weisen nach, dass die nackte U6 snRNA eine sehr kompakte Struktur hat, in Anwesenheit des Prp24 Proteins und der LSm Proteine die RNA des U6 Partikels aber eine weitaus offenere Struktur aufweist. Dies gilt offenbar besonders für den 3 -Stem Loop und für den großen assymetrischen internen Loop der U6 snRNA. In dieser Anordnung werden mehrere Nukleotide im U6 snRNP für Modifikation leicht zugänglich, welche in der nackten U6 RNA nicht modifiziert werden. Das Prp24 Protein hat eine starke Bindungsstelle an dem großen Loop (Nukleotide 40-60) und eine schwächere an dem 3 -Stem Loop im U6 snRNP. Eine Bindungsstelle für die LSm-Proteine im U6 snRNP konnte jedoch nicht bestimmt werden. Interessant ist, dass in Abwesenheit der LSm-Proteine der 3 -Stem Loop der U6 snRNA mit dem Prp24 Protein stärker gebunden ist. In der Anwesenheit des Prp24 Proteins und der LSm Proteine, nimmt der 3 -Stem Loop eine geöffnete Konformation an. Wir gehen von der Annahme aus, dass die Prp24 Protein-Bindung an der U6 snRNA die Watson-Crick Basenpaarungs-Stellen des assymetrischen Loops mit der U4 snRNA exponieren könnte. Zusätzlich kann man anmerken, dass die Bildung von Stem I und II des U4/U6 Duplexes durch die Kooperation der LSm Proteine mit dem Prp24 Protein vermittelt werden kann. Wir nehmen an, dass die geöffnete Struktur der Hefe U6 snRNA in nativen U6 Partikeln auch auf die beiden humanen snRNAs U6 und U6atac übertragen werden kann. Es konnte eine chaperonartige Aktivität der LSm Proteine bei der Bindung der U4 snRNA an U6 snRNA gezeigt werden. Wie die LSm Proteine mit dem Prp24 Protein im U6 snRNP interagieren, als auch wie der LSm-Komplex die U4/U6 Verbindung fördert ist jedoch nicht bekannt. Um zu verstehen, wie das Prp24 Protein und der LSm-Komplex räumlich organisiert sind, wurden hochreine U6 partikel mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Je nachdem ob die U6 Partikel chemisch fixiert sind oder nicht, zeigt das U6 snRNP im Elektronenmikroskop zwei unterschiedliche Konfigurationen: (1) eine geöffnete oder (2) eine kompakte Form. Die geöffnete Form hat eine langgestreckte Gestalt mit zwei deutlichen Substrukturen. Eine Domäne besitzt eine eher runde Form, während die andere kantig und eckig aussieht. Mit einem zentralen Kontrastmittel-Fleck zeigt die runde Substruktur das typische Erscheinungsbild des ringförmigen LSm-Komplexes. Die zweite Domäne enthält den großen Proteinbestandteil des U6 snRNPs, das Prp24 Protein. Die fixierten U6 snRNPs erscheinen wesentlich kompakter. Die zwei Substrukturen, des LSm-Rings und die Prp24 Protein-Domäne, sind nun kaum noch als getrennte Domänen zu erkennen. Die kompakte Struktur kann die Wechselwirkung zwischen das Prp24 Protein und den LSm-Proteinen bewerkstelligen, wie auch die im Two-Hybrid-Assay beobachteten Interaktionen zwischen Prp24 Protein und den LSm-Proteinen vermuten lassen. Obwohl die geöffnete Form des U6 snRNPs keine zufrieden stellende Detailwiedergabe ermöglichte, enthalten die fixierten U6 snRNPs gut definierte Klassensummen. Die kompakte Form des U6 snRNPs könnte die authentische Struktur sein, da die fixierten U6 Partikel eine relativ einheitliche 3D Struktur aufweisen. Um Informationen über Position der LSm-Proteine im Ring und im besonderen über Nähe zur Prp24 Protein-Domäne zu erfahren, wurden LSm-Proteine mit dem yECitrine-Protein markiert. Die Markierungsexperimente zeigten, dass die LSm4, -5, -6, -7, -8 Proteine deutlich entfernt von der Stelle des LSm-Rings, von der die Prp24 Protein-Domäne entspringt, liegen. Diese Experimente zeigten auch, dass die LSm2 und LSm3 Proteine wahrscheinlich nahe der Prp24 Protein-Bindungsstelle lokalisiert sind. Unsere UV-Crosslinking Experimente zeigten, dass das Prp24 Protein und das LSm2 Protein zu nahe beieinanderliegenden Nukleotiden UV quervernetzt werden können. Dies deutet drauf hin, dass das LSm2 protein, eventuell auch das LSm3 Protein, im LSm-Ring näher zur Prp24 Protein-Bindungsstelle positionert ist als die anderen LSm-Proteine. Die Markierungsexperimente bestätigten auch, dass die hauptsächlich aus Interaktionsdaten abgeleitete LSm-Protein-Abfolge 2-3-6-5-7-4-8 auch tatsächlich im LSm-Ring des U6 snRNPs so vorliegt. Unsere elektronenmikroskopische Analyse des unfixierten und fixierten U6 snRNPs lassen uns vermuten, dass die zwei Konfigurationen der geöffneten oder der kompakten Form des U6 snRNPs möglicherweise funktionell relevant sind. Der Wechsel von kompakter Form zu offener Form könnte durch die initiale Bindung der U4 snRNA veranlaßt sein, und so die späten Schritte der U4 snRNA-Bindung ermöglichen.