Functional Characterization of Hereditary Spastic Paraplegia Proteins Spastin and ZFYVE27

Abstract

Die Hereditären Spastischen Paraplegien (HSPs) sind eine heterogene Gruppe von genetischen Erkrankungen, die durch progressive spastische Lähmungen in den unteren Gliedmaßen gekennzeichnet sind, was hauptsächlich durch Funktionsstörungen der Pyramidenbahn-Neuronen verursacht wird. Alle Arten der Vererbung, wie autosomal dominant (AD), autosomal rezessiv (AR) und X-chromosomal, sind für HSP bekannt. Mutationen im SPG4/SPAST Gen sind der häufigste Grund für AD-HSP und machen bis zu 40% aller AD-HSP Fälle aus. In der vorliegenden Arbeit haben wir die funktionellen und strukturellen Eigenschaften des SPAST Genprodukts Spastin und dessen interagierenden Proteins ZFYVE27, ein HSP zugehöriges Protein, untersucht.Im ersten Teil der Arbeit wurde der oligomere Status von Spastin mit Hilfe von biochemischen und zellulären Ansätzen als Hexamer identifiziert. Außerdem wurden durch die Modellierung der Spastin AAA Domäne strukturelle Informationen über das Spastin- Hexamer erhalten. Diese modellierte Struktur diente wiederum als Gerüst, um die bekannten Spastin Mutationen bei HSP Patienten in vier funktionelle Gruppen einzuteilen.Im zweiten Teil der Arbeit wird über compound heterozygote Sequenzvarianten von SPAST berichtet, die ein frühes Auftreten des HSP Phänotyps verursachen. Ein modifier effect des bekannten Spastin-Polymorphismus (S44L) in Verbindung mit einer anderen Mutation wird beschrieben. Unsere Ergebnisse festigen ein Schwellenwert Modell von Spastin mit einer direkten Korrelation zwischen funktionellem Spastin-Level und frühem Auftreten des HSP Phänotyps.Im dritten Teil konnte eine Erweiterung des Spastin-Mutationsspektrums in einer großen HSP Kohorte mit 29 neuen Spastin-Mutationen beschrieben werden. Außerdem wurde versucht, alle möglichen negativen Effekte dieser neuen Mutationen auf die oligomere Funktion von Spastin mit Hilfe des Spastin Strukturmodells zu ermitteln.Im letzten Teil dieser Arbeit konnte mit Hilfe von zellulären und biochemischen Analysen gezeigt werden, dass ZFYVE27, ein mit Spastin interagierendes Protein, als Dimer/Tetramer wirkt. Weiterhin haben wir gezeigt, dass die Hauptinteraktionsregion, die hydrophobe Region 3 (HR3), zwar nicht wichtig für die Selbstassoziation von ZFYVE27 ist dafür aber essentiell für die Neuritenbildung. Die Coexpression des verkürzten ZFYVE27 (∆HR3184-208) erschwert die Funktion des Wild-Typ ZFYVE27.Außerdem wurde damit begonnen, loss of function und gain of function Mausmodelle für ZFYVE27 herzustellen. Damit kann die Rolle von ZFYVE27 im HSP Pathomechanismus studiert wurden. Denkbarerweise könnte das loss of function Mausmodell die phänotypischen Merkmale von HSP nachahmen. Mit der Analyse der Rolle von ZFYVE27 in der Neuritogenese/Neuropathie in den Mausmodellen wird es möglich sein, neue Erkenntnisse über den Pathomechanismus von HSP zu gewinnen.