Navigation ▼

Zur Kurzanzeige

dc.contributor.advisor Urlaub, Henning Dr. de
dc.contributor.author Schmidt, Carla de
dc.date.accessioned 2010-09-07T12:11:25Z de
dc.date.accessioned 2013-01-18T14:26:38Z de
dc.date.available 2013-01-30T23:51:13Z de
dc.date.issued 2010-09-07 de
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B694-8 de
dc.description.abstract Die Mehrzahl zellulärer Prozesse wird von Proteinkomplexen angetrieben. Diese treten entweder als multimere Proteinverbindungen oder komplexiert mit Liganden wie zum Beispiel RNA- oder DNA-Molekülen auf. Um die Details der zellulären Vorgänge zu verstehen ist eine Analyse der Proteinkomplexe erforderlich. Diese beinhaltet die Identifizierung der Proteinkomponenten, der Bestimmung der Proteinstöchiometrien, die relative Quantifizierung verschiedenener Komplexstadien sowie die Analyse der Protein-Protein- und Protein-Ligand-Interaktionen. Mehrere massenspektrometrische Methoden wurden entwickelt um diese Fragen zu beantworten und eine Hochdurchsatz-Analse der Proteinkomplexe zu ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Methoden auf das Spleißosom angewandt, welches eine Protein-RNA-Maschinerie darstellt, die das Herausschneiden von Introns und das Verbinden von Exons während dem eukaryotischen prä-mRNA-Spleißen katalysiert. Wir haben die absolute und die relative Quantifizierung mittels Massenspektrometrie angewandt um verschiedene spleißosomale Komplexe und Teilkomplexe in Hinsicht auf ihre Proteinkomposition und ihre Proteinstöchiometrie zu charakterisieren. Der spleißosomale hPrp19/CDC5L-Komplex besteht aus sieben Proteinen (hPrp19, Hsp70, CTNNBL1, PRL1, CDC5L, AD-002, and SPF27) und spielt eine entscheidende Rolle im Aufbau eines katytisch-aktiven Spleißosoms. Die genaue Proteinstöchiometrie in diesem Komplex wurde bis jetzt nicht erforscht. Aus diesem Grund haben wir eine Massenspektrometrie-basierende Quantifizierungsmethode aufgesetzt und haben den hPrp19/CDC5L-Komplex genutzt um die Methodik der absoluten Quantifizierung (AQUA) mit Hilfe von Standardpeptiden in Kombination mit multiple reaction monitoring (MRM) zu etablieren. Die Analysen haben ergeben, daß der hPrp19/CDC5L-Komplex vier Kopien des hPrp19-Proteins, zwei Kopien des CDC5L-Proteins und je eine Kopie der Proteine SPF27, PRL1 und CTNNBL1 beinhaltet. In weiteren Studien haben wir eine Hochdurchsatz-Quantifizierung zweier spleißosomaler Komplexe, und zwar dem prä-katalytischen und dem katalytisch-aktiven Spleißosom (spleißosomaler Komplexe B und C), durchgeführt. Hierfür wurde eine Methode der relativen Quantifizierung, welche die Markierung mit iTRAQ-Reagenzien (isobaric tags for relative and absolute quantification) von in-gel hydrolysierten Proteinen beinhaltet, optimiert und zur Quantifizierung der zwei Komplexe angewandt. Die Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen der relativen Quantifizierung mittels metabolischer Markierung (SILAC; stable isotope labeling with amino acids in cell culture) und der semi-quantitativen Spectral Count-Methode verglichen. Hierbei haben wir haben eine gute Übereinstimmung der eingesetzten Methoden gefunden. Eine Vielzahl von Proteinen, welche überwiegend mit dem B- oder C-Komplex assoziiert sind und nur eine geringe Anzahl an Proteinen, welche in gleichen Mengen in beiden Komplexen vertreten sind, wurden identifiziert. Das dynamische Verhalten des Spleißosoms während seiner Assemblierung wurde somit verdeutlicht. Im abschließenden Teil dieser Arbeit wurden die dynamischen Proteinänderungen während des prä-mRNA-Spleißens untersucht. Hierfür wurden die Proteinzusammensetzungen auf verschiedenen prä-mRNAs zu verschiedenen Zeitpunkten mittels stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) verglichen. Die generierten Zeitreihen für die Assemblierung von spleißosomalen Proteingruppen während des Spleißvorgangs sind hilfreich um den Vorgang des prä-mRNA-Spleißens zu verstehen. de
dc.format.mimetype application/pdf de
dc.language.iso eng de
dc.rights.uri http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ de
dc.title Absolute and relative quantification of proteins in large protein-RNA assemblies by mass spectrometry de
dc.type doctoralThesis de
dc.title.translated Absolute und relative Quantifizierung von Proteinen in großen Protein-RNA-Komplexen mittels Massenspektrometrie de
dc.contributor.referee Urlaub, Henning Dr. de
dc.date.examination 2010-06-08 de
dc.subject.dnb 500 Naturwissenschaften allgemein de
dc.description.abstracteng The majority of cellular processes is driven by protein complexes. These emerge as multimeric protein assemblies or are complexed with ligands such as RNA or DNA. To understand the details of the cellular process, an analysis of the protein complexes is required. This involves the identification of the protein components, the determination of the protein stoichiometries, the relative quantification of different complex states, and the study of protein-protein or protein-ligand interactions. Several mass spectrometry-based techniques have been developed to tackle these problems and greatly facilitating the high throughput analysis of protein complexes. In this study, these methods have been applied to the spliceosome, which is a protein-RNA machinery that catalyzes the excision of introns and the ligation of exons during eukaryotic pre-mRNA splicing. We used absolute and relative quantification by mass spectrometry to characterize different spliceosomal complexes or subcomplexes, in terms of their protein composition and protein stoichiometry. One spliceosomal subcomplex, the hPrp19/CDC5L complex, consists of seven individual proteins (hPrp19, Hsp70, CTNNBL1, PRL1, CDC5L, AD-002, and SPF27) and plays a crucial role in the assembly of a catalytically active spliceosome. The exact protein stoichiometries within this particular protein complex have not yet been investigated. We therefore set up a mass spectrometry-based quantification method and used the hPrp19/CDC5L complex to implement the methodology of absolute quantification (AQUA) with the help of synthetic standard peptides in combination with multiple reaction monitoring (MRM). The analyses revealed that the hPrp19/CDC5L complex consists of four copies of hPrp19, two copies of CDC5L, and one copy each of SPF27, PRL1, and CTNNBL1. In a different series of investigation, we set out to make a high throughput relative quantification of two distinct spliceosomal complexes, namely the pre-catalytic and the catalytically active spliceosomes (spliceosomal B and C complexes). For this purpose, a relative quantification approach involving iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantification) labeling of in-gel digested proteins was optimized and applied to the two complexes. The results were compared to relative quantification by metabolic labeling (SILAC; stable isotope labeling with amino acids in cell culture) and semi-quantitative spectral count from proteomic analysis of the B and C complexes. We found an overall good agreement for the used quantification methods. Several proteins were found to be pre-dominantly associated with spliceosomal B or C complexes, and only few proteins were found to be present in equal amounts within the two complexes. The high dynamics of the spliceosome during its assembly pathway was thus clearly demonstrated. In a final scene of investigation, we analyzed the dynamic protein changes during the pre-mRNA splicing process. To this end, the protein compositions on different pre-mRNAs at different time points were compared by stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC). The generated timelines for the assembly of whole groups of spliceosomal proteins during spliceosomal assembly and splicing catalysis are extremely helpful in understanding the dynamic process of pre-mRNA splicing. de
dc.contributor.coReferee Ficner, Ralf Prof. Dr. de
dc.subject.topic Mathematics and Computer Science de
dc.subject.ger Massenspektrometrie de
dc.subject.ger absolute Quantifizierung de
dc.subject.ger relative Qauntifizierung de
dc.subject.ger Proteinkomplexe de
dc.subject.eng mass spectrometry de
dc.subject.eng absolute quantification de
dc.subject.eng relative quantification de
dc.subject.eng protein complexes de
dc.subject.bk 35.26 Massenspektrometrie de
dc.identifier.urn urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2601-2 de
dc.identifier.purl webdoc-2601 de
dc.affiliation.institute Göttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und molekulare Biowissenschaften (GGNB) de
dc.subject.gokfull SRE 730 Massenspektrometrie de
dc.identifier.ppn 73789721X de

Dateien

Das Dokument erscheint in:

Zur Kurzanzeige