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Molecular mechanism of Inhibition of the CREB-coactivator TORC by the mitogen-activated kinase DLK in pancreatic beta-cells

dc.contributor.advisorOetjen, Elke PD Dr.de
dc.contributor.authorDo, Thanh Phude
dc.date.accessioned2012-05-16T12:11:26Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:49Zde
dc.date.issued2010-09-08de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B695-6de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-1382
dc.description.abstractDer ubiquitär exprimierte Transkriptionsfaktor CREB ist an zahlreichen zellulären Signaltransduktionswegen einschließlich der Regulation des Stoffwechsels, des Zellzyklus und überlebens, des Zellwachstums und der Immunregulation beteiligt. Drei Isoformen des Transducer of Regulated CREB (TORC) wurden kürzlich als weitere Kofaktoren von CREB identifiziert. Die Phosphorylierung von TORC2 am Ser-171 bzw. von TORC1 am Ser-167 führt zu einer Interaktion mit 14-3-3 Proteinen, wodurch TORC im Zytosol verbleibt. Die Dephosphorylierung dieser Aminosäuren resultiert in der nukleären Lokalisation von TORC, wo es mit dem homodimesierten Leuzin-Zipper von CREB interagiert und so die CREB-abhängige Gentranskription vermittelt. Eine frühere Untersuchung zeigte, daß die Dual Leucine Zipper Kinase DLK die durch Membrandepolarisation stimulierte CREB-abhängige Gentranskription in Beta-Zellen hemmte. Da die Rekrutierung von TORC notwendig für die volle transkriptionelle Aktivität von CREB ist, könnte TORC ein Ziel von DLK sein. In der vorliegenden Untersuchung wurde die Regulation von TORC durch die DLK untersucht. Hierzu wurde die Wirkung von DLK auf die transkriptionelle Aktivität von TORC in Beta-Zellen mittels Luciferasereportergenassays untersucht. Eine Interaktion zwischen DLK und TORC wurde durch in vitro Protein-Proteininteraktionsassays und Koimmunpräzipitation analysiert. Für die Untersuchungen zur Phosphorylierung von TORC durch DLK wurden Western Blot Analysen und in vitro Kinaseassays eingesetzt. Die Wirkung von DLK auf die nukleäre Translokation von TORC und die Rekrutierung an CRE enthaltende Promotoren wurde mittels immunzytochemischen Untersuchungen, Chromatinimmunpräzipitation und Luciferasereportergenassays untersucht. DLK hemmte die transkriptionelle Aktivität aller drei TORC Isoformen. Diese hemmende Wirkung war abhängig von der Fähigkeit DLK s zu homodimerisieren und von ihrer Kinaseaktivität. Der in vitro Kinase Assay zeigte, daß weder TORC1 noch TORC2 direkte Substrate der Kinase waren. Jedoch zeigte sich im Immunoblot, daß die Überexpression von DLK zu einer verstärkte Phosphorylierung von TORC1 am Ser-167 und an anderen nicht identifizierten Aminosäuren führte. Zusätzliche Behandlung der HIT Zellen mit einem Hemmstoff von JNK, einer der DLK untergeordneten Kinase, reduzierte die Phosphorylierung von TORC1 am Ser-167 und hob die langsamere Migration weiterer phospho-TORC1 Banden auf. Diese Daten lassen vermuten, daß DLK wahrscheinlich durch Aktvierung von JNK die Phosphorylierung von TORC induziert. Neben einer Phosphorylierung konnte mittels in vitro Protein-Protein Interaktionsassays und Koimmunpräzipitationen gezeigt werden, daß DLK mit TORC interagiert. Diese Interaktion war abhängig von der Fähigkeit DLK s zu homodimerisieren, da die DLK-PP Mutante in einem deutlich geringeren Ausmaß als DLK Wildtyp an das immobilisierte His-TORC Fusionsprotein band. Da DLK Wildtyp und seine Kinase-tote Mutante in demselben Ausmaß mit immobilisierten His-TORC Fusionsprotein interagierten, kann geschlossen werden, daß die Ausbildung eines Leuzin-Zippers notwendig für die DLK TORC Interaktion ist. Ebenfalls scheint die coiled-coil Stuktur, die durch die N-terminalen Domänen des TORC Tetramers gebildet wird, für die Interaktion mit dem Leuzin-Zipper von DLK erforderlich zu sein. In Abhängigkeit von seiner enzymatischen Aktivität verminderte DLK die nukleäre Lokalisation von TORC und die TORC-abhängige, CRE-dirigierte Gentranskription. Die Chromatinimmunpräzipitation zeigte, daß DLK die Rekrutierung von TORC an einen CRE enthaltenden Promotor verminderte. Zusammengefaßt zeigt die vorliegende Untersuchung, daß TORC ein Ziel der hemmenden Wirkung von DLK in Beta-Zellen ist. Die DLK induzierte Hemmung von TORC stellt einen neuen Signalweg dar, der durch Modifikation der CREB-abhängigen Gentranskription zur Regulation von Apoptose und Proliferation in Beta-Zellen beiträgt. Die Hemmung von DLK in Beta-Zellen könnte somit ein Ziel für die Therapie des Diabetes mellitus darstellen.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleMolecular mechanism of Inhibition of the CREB-coactivator TORC by the mitogen-activated kinase DLK in pancreatic beta-cellsde
dc.typedoctoralThesisde
dc.contributor.refereeHeinrich, Ralf Prof. Dr.de
dc.date.examination2010-07-21de
dc.subject.dnb500 Naturwissenschaften allgemeinde
dc.description.abstractengThe ubiquitously expressed transcription factor CREB is involved in numerous cell signalling pathways including metabolic process, cell cycle or survival, cell growth and immune regulation. Recently, the three isoforms of Transducer of Regulated CREB (TORC) have been identified as additional CREB co-activators. TORC2 phosphorylated on Ser-171, or TORC1 phosphorylated on Ser-167, is retained in the cytosol by binding to the 14-3-3 proteins. Upon dephosphorylation of TORC on these residues, TORC translocates to the nucleus, interacts with the dimerized leucine zipper of CREB and confers transcriptional activity to CREB-dependent genes. A previous study showed that the dual leucine zipper kinase DLK inhibits membrane depolarization-induced CREB transcriptional activity in a beta-cell line. The recruitment of TORC is required for CREB transcriptional activity. Therefore, TORC might be a target of DLK action. In the present study the effect of DLK on the regulation of TORC activity was investigated. To this aim the effect of DLK on the transcriptional activity of TORC in the beta-cell line HIT-T15 was examined using luciferase reporter gene assays. The interaction between DLK and TORC was tested by in vitro protein interaction assays and by co-immunoprecipitation assays. Whether DLK is able to result in phosphorylation of TORC was elucidated by Western blot and in vitro kinase assays. Finally, the effect of DLK on the nuclear translocation of TORC and the recruitment of TORC to a CRE-containing promoter were investigated by immunocytochemistry and by chromatin-immunoprecipitation assay in cooperation with luciferase reporter gene assays. DLK inhibited the transcriptional activities of all three TORC isoforms. This inhibitory action was dependent on the ability of DLK to homodimerize via its leucine zipper domain as well as on its enzymatic activity. Neither TORC1 nor TORC2 were direct substrates of DLK, since both coactivators were not phosphorylated in the in vitro kinase assay. However, the Western blot analysis showed that DLK induced the phosphorylation of TORC1 on Ser-167 and presumably on other as yet unidentified residues, as suggested by the retarded migration of TORC1. Interestingly, treatment of HIT cells with SP600125, a JNK inhibitor, reduced pronouncedly the Ser-167 phosphorylation of TORC1 regardless of the presence or absence of overexpressed DLK. Taken into account that DLK is able to phosphorylate and thus to activate JNK, these findings indicate, that DLK presumable through activation of its down-stream kinase JNK results in the phosphorylation of TORC. Besides induction of TORC phosphorylation, DLK directly interacts with TORC as shown by in vitro pull down assays and co-immunoprecipitation assays. This interaction depended on DLK s ability to homodimerize, since the DLK-PP mutant bound to a lesser extent to the immobilized His-TORC fusion protein. The finding that both DLK wild-type and its kinase-dead mutant bound to the same extent to immobilized His-TORC fusion protein indicates that the formation of a leucine zipper structure is required for the TORC-DLK interaction. The coiled-coil structure formed by the N-terminal domains of tetramerized TORCs seems to be required for the interaction with the leucine zipper of DLK. In addition, DLK depending on its enzymatic activity reduced the nuclear translocation of TORC and TORC-dependent CRE-directed gene transcription as shown by immunocytochemistry and reporter gene assay, respectively. Moreover, the chromatin-immunoprecipitation assay demonstrated that DLK prevented the recruitment of TORC to a CRE-containing promoter. Taken together, the present study shows that TORC is a target of the inhibitory action of DLK in beta-cells. The DLK-induced inhibition of TORC is a newly identified pathway, which may through regulation of CREB-dependent gene transcription govern the apoptosis and the proliferation of beta-cells, and thereby represent possibly a new target for the treatment of diabetes.de
dc.contributor.coRefereeMelchior, Frauke Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerCREBde
dc.subject.gerTORCde
dc.subject.gerDLKde
dc.subject.gerBeta-Zellende
dc.subject.gerHemmungde
dc.subject.gerDiabetesde
dc.subject.engCREBde
dc.subject.engTORCde
dc.subject.engDLKde
dc.subject.engbeta-cellsde
dc.subject.enginhibitionde
dc.subject.engdiabetesde
dc.subject.bk42.13de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2603-3de
dc.identifier.purlwebdoc-2603de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWF 200: Molekularbiologiede
dc.identifier.ppn63556355Xde


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