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Nachweis und Aufreinigung von Abscisinsäure-bindenden Proteinen aus dem Cytosol von Spinat- und Arabidopsis-Pflanzen

detection and purification of abscisic acid-binding proteins in the cytosol of spinach and Arabidopsis plants

by Michaela Strauß
Doctoral thesis
Date of Examination:2002-04-24
Date of issue:2003-01-09
Advisor:Prof. Dr. Dieter Heineke
Referee:Prof. Dr. Dieter Heineke
Referee:Prof. Dr. Hans-Walter Heldt
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1400

 

 

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Name:strauss.pdf
Size:1.92Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

Goal of this work was to isolate abscisic acid binding proteins of spinach and Arabidopsis plants. Therefore the use of different proteinbiochemic methods like ammoniumsulfate-precipitation and chromatography principles were necessary. For the detection of abscisic acid binding proteins a none competitive ELISA was estabilsh. ABA-BSA-conjugates were used as linkers for the detection of ABA-binding proteins. Therefore a coppling reaction of ABA on BSA was estabilsh. One BSA-molecule binds about 21 ABA-moleclues. The immunisation with these conjugates of two rabbits leds to specific antibodys against ABA. The Kd-constant was 36.8 nM, measured with 3H-ABA. Spinach proteins isolated by gel chromatography showed no spezific binding of ABA-BSA-conjugates. The protein-extracts of Arabidopsis separated by ion exchange chromatography led to high ABA-BSA-conjugate binding in some fractions. One of these fraction war purified with ABA-affinity-chromatography. In the end two Proteins with an molecular weight of 50 and 52 kDa were purified.
Keywords: abscisic acid; ABA; ABA-binding proteins; ELISA; chromatography

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Ziel der vorliegenden Arbeit war es, cytosolische ABA-bindende Proteine aus Pflanzenextrakten zu isolieren und nachzuweisen. Dazu wurden Proteine aus Spinat- und Arabidopsis-Pflanzen durch verschiedene proteinbiochemische Methoden wie Ammoniumsulfat-Fällung und Säulenchromatographie aufgereinigt. Für den Nachweis ABA-bindender Proteine wurde als Detektionsverfahren ein nicht-kompetitiver ELISA etabliert. ABA-BSA-Konjugate wurden im ELISA als Sonden zum Nachweis ABA-bindender Proteine eingesetzt. Dazu wurde die Kopplung von ABA an BSA als Trägerprotein in dieser Arbeit durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß pro BSA-Molekül durchschnittlich 21 ABA-Moleküle gebunden wurden. Diese ABA-BSA-Konjugate wurden zur Immunisierung von zwei Kaninchen verwendet. Die gewonnenen polyklonalen Antikörper erwiesen sich als spezifisch gegenüber ABA. Aus Experimenten, bei denen die Konkurrenz von 3H-ABA und ABA um die Bindung an den Antikörper untersucht wurde, konnte ein Kd-Wert von 36,8 nM für den ABA/Antikörper-Komplex erhalten werden. Eine Aufreinigung von Proteinen aus Spinatpflanzen mittels Gelfiltrations-Chromatographie ergab keine spezifische ABA-BSA-Konjugat Bindung. Von den durch Aufreinigung von Arabidopsis-Proteinen mittels Kationenaustauscher-Chromatographie erhaltenen Fraktionen zeigten mehrere eine hohe ABA-BSA-Konjugat-Bindung. Bei der weiteren Aufreinigung einer dieser Fraktionen durch ABA-Affinitäts-Chromatographie wurden zwei ABA-bindende Proteine mit einem Molekulargewicht von 50 kDa und 52 kDa nachgewiesen.
Schlagwörter: Abscisinsäure; ABA; ABA-bindende Proteine; ELISA; Chromatography
 

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