Nachweis und Aufreinigung von Abscisinsäure-bindenden Proteinen aus dem Cytosol von Spinat- und Arabidopsis-Pflanzen
detection and purification of abscisic acid-binding proteins in the cytosol of spinach and Arabidopsis plants
by Michaela Strauß
Date of Examination:2002-04-24
Date of issue:2003-01-09
Advisor:Prof. Dr. Dieter Heineke
Referee:Prof. Dr. Dieter Heineke
Referee:Prof. Dr. Hans-Walter Heldt
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Goal of this work was to isolate abscisic acid binding proteins of spinach and Arabidopsis plants. Therefore the use of different proteinbiochemic methods like ammoniumsulfate-precipitation and chromatography principles were necessary. For the detection of abscisic acid binding proteins a none competitive ELISA was estabilsh. ABA-BSA-conjugates were used as linkers for the detection of ABA-binding proteins. Therefore a coppling reaction of ABA on BSA was estabilsh. One BSA-molecule binds about 21 ABA-moleclues. The immunisation with these conjugates of two rabbits leds to specific antibodys against ABA. The Kd-constant was 36.8 nM, measured with 3H-ABA. Spinach proteins isolated by gel chromatography showed no spezific binding of ABA-BSA-conjugates. The protein-extracts of Arabidopsis separated by ion exchange chromatography led to high ABA-BSA-conjugate binding in some fractions. One of these fraction war purified with ABA-affinity-chromatography. In the end two Proteins with an molecular weight of 50 and 52 kDa were purified.
Keywords: abscisic acid; ABA; ABA-binding proteins; ELISA; chromatography
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Ziel der vorliegenden Arbeit war es, cytosolische
ABA-bindende Proteine aus Pflanzenextrakten zu
isolieren und nachzuweisen. Dazu wurden Proteine aus
Spinat- und Arabidopsis-Pflanzen durch verschiedene
proteinbiochemische Methoden wie Ammoniumsulfat-Fällung
und Säulenchromatographie aufgereinigt. Für den
Nachweis ABA-bindender Proteine wurde als
Detektionsverfahren ein nicht-kompetitiver ELISA
etabliert.
ABA-BSA-Konjugate wurden im ELISA als Sonden zum
Nachweis ABA-bindender Proteine eingesetzt. Dazu wurde
die Kopplung von ABA an BSA als Trägerprotein in dieser
Arbeit durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß pro
BSA-Molekül durchschnittlich 21 ABA-Moleküle gebunden
wurden. Diese ABA-BSA-Konjugate wurden zur
Immunisierung von zwei Kaninchen verwendet. Die
gewonnenen polyklonalen Antikörper erwiesen sich als
spezifisch gegenüber ABA. Aus Experimenten, bei denen
die Konkurrenz von 3H-ABA und ABA um die Bindung an den
Antikörper untersucht wurde, konnte ein Kd-Wert von
36,8 nM für den ABA/Antikörper-Komplex erhalten
werden.
Eine Aufreinigung von Proteinen aus Spinatpflanzen
mittels Gelfiltrations-Chromatographie ergab keine
spezifische ABA-BSA-Konjugat Bindung. Von den durch
Aufreinigung von Arabidopsis-Proteinen mittels
Kationenaustauscher-Chromatographie erhaltenen
Fraktionen zeigten mehrere eine hohe
ABA-BSA-Konjugat-Bindung. Bei der weiteren Aufreinigung
einer dieser Fraktionen durch
ABA-Affinitäts-Chromatographie wurden zwei ABA-bindende
Proteine mit einem Molekulargewicht von 50 kDa und 52
kDa nachgewiesen.
Schlagwörter: Abscisinsäure; ABA; ABA-bindende Proteine; ELISA; Chromatography