Molecular and cellular Mechanisms controlling Primordial Germ Cell Migration in Zebrafish

Abstract

Im Zebrafisch spezifizieren sich die primordialen Keimzellen schon im frühen Stadium der embryonalen Entwicklung und migrieren anschließend zur Region wo die Gonaden gebildet werden, wo sie sich schlussendlich zu Gameten (Eier oder Spermien) entwickeln. Das Chemokin SDF-1 wird von somatischen Mesoderm Zellen exprimiert und dient als Wegweiser für die migrierenden Keimzellen, die wiederum den korrespondierenden Rezeptor CXCR4b exprimieren.Hier beschreiben wir die Klonierung der Promoter-Region des Gens askopos, welche wir an ein Reporter-Gen und bestimmte RNA Elemente fusioniert haben, die wiederum zur spezifischen Stabilisierung und Translation der RNA in den Keimzellen führte. Wir benutzten dieses Konstrukt um einen transgenen Fisch zu erzeugen, welcher uns erlaubte, die Entwicklung der primordialen Keimzellen während den frühen embryonalen Entwicklungsphasen zu verfolgen. Diese Analyse offenbarte uns verschiedene Phasen der primordialen Keimzellentwicklung. Während der letzten Phase ändern die primordialen Keimzellen ihr Verhalten und beginnen zu migrieren. Erst ab dieser Phase können die Keimzellen auf das von somatischen Zellen exprimierte SDF-1a reagieren und geleitet werden. Zusätzlich detektierten wir eine Reduzierung des Proteins E-cadherin beim Eintritt in die letzte Phase der primoridalen Keimzellentwicklung. Nebenbei konnten wir auch zeigen, dass die letzte Phase von der Funktion des Dead end Proteins und von de novo Transkription abhängt.Nachdem die Keimzellen das migrieren erlernt haben, können sie sofort aktiv in Richtung SDF-1a migrieren. In dem Bestreben herauszufinden wie das Chemokin Signal von der Zelle in ausgerichtete Migration interpretiert wird, haben wir die Beobachtung gemacht, dass migrierende Keimzellen konstant hohe Kalzium Konzentrationen an der Front aufweisen. Manipulationen der Kalzium-Verteilung in der Zelle resultierten in schwerwiegenden Problemen der Zell-Polarisation und Migration. Solch manipulierte Keimzellen zeigten eine ungewöhnlich hohe Anzahl an Protrusion, was die Migrationsgeschwindigkeit so stark beeinflusste, dass viele Keimzellen in ektopischen Regionen im Embryo wieder gefunden wurden. Um die molekulare Kaskade zu ermitteln, die von Kalzium aktiviert wird, analysierten wir die Funktion von MLCK in dem Prozess der Keimzell-Migration. Wir entdeckten, dass MLCK in der Front von migrierenden primordialen Keimzellen lokalisiert und dass die Aktivität von MLCK wichtig ist für die kontrollierte Formation von Protrusion. In der Tat, bei der Expression von einer aktivierten und einer dominant negativen Form von MLCK, zeigten die Keimzellen Probleme bei der Polarisierung, der Protrusion-Formation und ein drastischer Anstieg der verbrachten Zeit in der tumbling -Phase wurde registriert. Ebenso konnten wir die Aktivierung von myosin hauptsächlich an der Front von migrierenden primordialen Keimzellen detektieren. Die erhöhte Kalziumkonzentration an der Front könnte schlussendlich wichtig sein, um die Aktivität von MLCK zu regulieren, welche andererseits die Kontraktion vom Acto-myosin Kortex auslöst, und damit die Formation von Protrusion an der Front der Zelle und beständige Migration ermöglicht.