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Identification and Characterization of Microbial Key Functions in Soils of the German Biodiversity Exploratories Representing Different Land Use and Management Types

Identifizierung und Charakterisierung von mikrobiellen Schlüsselfunktionen in Böden unterschiedlichen Landnutzungs- und Managementtyps der deutschen Biodiversitäts-Exploratorien

by Heiko Nacke
Doctoral thesis
Date of Examination:2011-10-20
Date of issue:2012-05-11
Advisor:PD Dr. Rolf Daniel
Referee:PD Dr. Rolf Daniel
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Liebl
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1477

 

 

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Abstract

English

Soil probably harbors the highest microbial species diversity of any environment on Earth and represents a major reservoir of microbial taxonomic, genomic, and metabolic diversity. The most promising approach to gain insights into diversity and structure of soil microbial communities is the application of cultivation-independent techniques. In addition, these techniques are also valuable tools for the recovery of novel natural products from soils. In this study, forest and grassland soil samples derived from the German Biodiversity Exploratories Schorfheide-Chorin, Hainich-Dün, and Schwäbische Alb were analyzed by applying metagenomic approaches. Environmental DNA was isolated from topsoil and subsoil samples covering different management types. Phylogenetic analysis of forest and grassland samples from the Schwäbische Alb (topsoil) and grassland samples from the Hainich (topsoil and subsoil) was performed using 16S rRNA gene-based amplicon pyrosequencing. Bacterial diversity was higher in grassland soils than in forest soils on the phylum level. In addition, a soil depth effect was recorded; topsoil samples exhibited a higher bacterial diversity than subsoil samples. In forest soils, which covered a wide pH range, diversity was significantly influenced by pH and tree species. A high number of bacterial groups showed strong correlations to soil pH at different taxonomic level. This pH effect was not found in Hainich grassland soil samples, because of the small pH range covered by these samples. Instead of pH, organic carbon content induced statistically significant effects on bacterial community structure at the near-neutral pH of the Hainich soil samples. Moreover, 14 plasmid and nine fosmid libraries were constructed from environmental DNA of all three German Biodiversity Exploratories. Partial function-based screening of the metagenomic libraries for lipolytic and (hemi)cellulolytic genes resulted in the identification of 37 unique lipolytic and three individual (hemi)cellulolytic clones. Sequencing and subsequent analysis of insert DNA of these clones was carried out. Thirty-five gene products of the 37 identified lipolytic genes were new members of families I (true lipases), IV, V, VI, and VIII of lipolytic enzymes. The remaining two gene products represent putatively new families of lipolytic enzymes. Insert DNA of two of the three (hemi)cellulolytic clones harbored xylanase-encoding genes whereas insert DNA of the remaining clone contained a cellulase-encoding gene. Amino acid sequence analysis of the gene products revealed that the putative cellulase harbored a family 9 carbohydrate-binding module which was so far only detected in xylanases. Initial characterization of the two xylanases showed that both enzymes exhibit high activity over a wide range of temperatures and pH values. In addition, biochemical characterization of the purified cellulase was performed. The enzyme was highly active over a wide pH range and showed high halotolerance.
Keywords: Soil metagenome; pyrosequencing; bacterial diversity; metagenomic libraries; lipolytic enzymes; (hemi)cellulolytic enzymes

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Boden beherbergt wahrscheinlich die höchste mikrobielle Artenvielfalt auf der Erde und stellt ein Hauptreservoir für taxonomische, genomische und metabolische Vielfalt von Mikroorganismen dar. Der vielversprechendste Ansatz um Einblicke in die Diversität und Struktur von mikrobiellen Gemeinschaften des Bodens zu gewinnen, ist die Anwendung von kultivierungsunabhängigen Methoden. Außerdem sind diese Methoden wertvoll für die Gewinnung von neuartigen natürlichen Produkten aus Boden. In dieser Studie wurden Wald- und Grünlandbodenproben aus den deutschen Biodiversitäts-Exploratorien Schorfheide-Chorin, Hainich-Dün und Schwäbische Alb mit Hilfe von metagenomischen Methoden analysiert. Aus Ober- und Unterbodenproben, die verschiedene Managementtypen abdecken, wurde Umwelt-DNA isoliert. Durch 16S rRNA Gen-basierte Amplikon Pyrosequenzierung wurde eine phylogenetische Analyse von Grünland- und Waldproben der Schwäbischen Alb (Oberboden) und Grünlandproben des Hainichs (Ober- und Unterboden) ermöglicht. Die bakterielle Diversität war auf der Phylumebene in Grünlandböden größer als in Waldböden. Außerdem konnte ein Effekt der Bodentiefe aufgedeckt werden, diesbezüglich wiesen Oberbodenproben eine höhere Diversität gegenüber Unterbodenproben auf. Innerhalb der Waldböden, die einen breiten pH-Bereich abdeckten, konnte ein signifikanter Einfluss des pH-Wertes sowie der Baumart auf die bakterielle Diversität nachgewiesen werden. Zahlreiche bakterielle Gruppen zeigten auf unterschiedlicher taxonomischer Ebene starke Korrelationen gegenüber dem pH-Wert des Bodens. Dieser pH-Effekt konnte jedoch nicht in den Hainich-Grünlandbodenproben nachgewiesen werden, da ein geringer pH-Bereich durch diese Proben abgedeckt wurde. Stattdessen rief der organische Kohlenstoffgehalt der nahezu neutralen Hainich-Bodenproben statistisch signifikante Effekte gegenüber der Struktur der bakteriellen Gemeinschaften hervor. Unter Verwendung von Umwelt-DNA aus den drei deutschen Biodiversitäts-Exploratorien wurden 14 Plasmid- und 9 Fosmidbanken konstruiert. Die partielle Durchmusterung dieser metagenomischen Genbibliotheken nach lipolytischen und (hemi)cellulolytischen Genen resultierte in der Identifizierung von 37 unterschiedlichen lipolytischen Klonen und 3 verschiedenen (hemi)cellulolytischen Klonen. Die Insert-DNA dieser Klone wurde sequenziert und anschließend analysiert. Es zeigte sich dass 35 Genprodukte der 37 identifizierten lipolytischen Gene bisher unbekannte Vertreter der Lipase-/Esterasefamilien I (echte Lipasen), IV, V, VI und VIII darstellen. Die übrigen beiden Genprodukte repräsentieren Vertreter potentiell neuer Lipase-/Esterasefamilien. Die Insert-DNA von zwei der drei (hemi)cellulolytischen Klone beherbergte Xylanase-kodierende Gene, wogegen die Insert-DNA des übrigen Klones ein Cellulase-kodierendes Gen beinhaltete. Eine Aminosäuresequenzanalyse der Genprodukte zeigte, dass die putative Cellulase eine Kohlenhydratbindedomäne der Familie 9 beherbergt, die zuvor lediglich in Xylanasen detektiert wurde. Durch initiale Charakterisierung der beiden Xylanasen konnte ermittelt werden, dass beide Enzyme eine hohe Aktivität innerhalb eines breiten Temperatur- und pH-Bereichs aufweisen. Außerdem wurde eine biochemische Charakterisierung der Cellulase vorgenommen. Das Enzym war sehr salztolerant und wies eine hohe Aktivität innerhalb eines breiten pH-Bereichs auf.
Schlagwörter: Bodenmetagenom; Pyrosequenzierung; bakterielle Diversität; metagenomische Genbibliotheken; lipolytische Enzyme; (hemi)cellulolytische Enzyme
 

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