Zirkulierende Nukleinsäuren als molekulare Marker zur Trächtigkeitsbestimmung beim Rind

Abstract

Zirkulierende Nukleinsäuren (CNAs) sind sowohl DNA, als auch RNA Moleküle, die im Blutkreislauf von gesunden und erkrankten Individuen als freie oder in Mikrovesikeln verpackte Nukleinsäuren existieren. In dieser Arbeit wurden CNA Profile im Serum trächtiger und nicht trächtiger Kühe zu einem frühen Zeitpunkt post inseminationem (p.i.) erstellt. Dabei sollten diese CNAs als potentielle Biomarker die molekulargenetischen Differenzierungsprozesse im reproduktiven Gewebe widerspiegeln. Die CNAs wurden mit einem modifizierten SuperSAGE Verfahren (Serial Analysis of Gene Expression) aufbereitet. Dabei wurden kurze Sequenzabschnitte (Tags) generiert und anschließend mit dem Roche/454 GS FLX Titanium sequenziert. Die Auswertung der 454 Sequenzierungsdaten ergab in der Verteilung der Tag Treffer auf definierten Bereichen der bovinen Chromosomen, sowie auf repetitiven Elementen signifikante Unterschiede zwischen Proben trächtiger und nicht trächtiger Kühe. Die anschließende Validierung der repetitiven Tag Sequenzen bestätigten diese Gruppenunterschiede. Mit Hilfe der ROC Analyse wurden die qPCR Ergebnisse bewertet. Dabei wurden für die Art2A und BovB Fragmente am d 20 23 p.i. eine Richtig Positiv Rate von 63 % 71 % der trächtigen Kühe sowie eine Richtig Negativ Rate von 83 % 86 % ermittelt. Die besten Resultate wies dabei das 2_3_BovB qPCR Experiment auf. Zusätzlich erfolgte eine epigenetische Untersuchung der CNA Methylierungsmuster mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen und der SOLiDTM Sequenzierung. Die Analyse der SOLiDTM Sequenzierungsdaten ergab für den frühen Trächtigkeitsverlauf Unterschiede im Methylierungsgrad von Sequenz Treffern innerhalb von definierten chromosomalen Regionen und in Gen Bereichen. Dabei wurden Gene ermittelt, die mit Entwicklungsprozessen während des Trächtigkeitsverlaufes assoziiert werden konnten. Insgesamt konnten spezifische CNA Fragmente identifiziert werden, die mit einer Trächtigkeit assoziiert sind und mit großer Wahrscheinlichkeit vom wachsenden Gewebe der Plazenta entstammten.