Genome-wide RNAi screening reveals glial phosphoethanolamine ceramide is critical for axonal ensheathment
Ein Genom-weiter RNAi-Screen zeigt, dass Phosphoethanolamin-Ceramid in Glia wichtig für das Umhüllen von Axonen ist
by Aniket Ghosh
Date of Examination:2012-07-26
Date of issue:2012-11-07
Advisor:Prof. Dr. Mikael Simons
Referee:Prof. Dr. Mikael Simons
Referee:Prof. Dr. Herbert Jäckle
Referee:Prof. Dr. Stefan Eimer
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Abstract
English
Glia play a major role in many processes during the development of the nervous system both in vertebrates and in invertebrates. One of the crucial functions of glia is the insulation of axons to provide them with trophic support. This insulation renders electrical isolation to allow faster conduction of nerve impulses. This project aimed to identify novel glia-specific functions that alter axonal morphology. In this study, we first characterized a Drosophila model to study glial specific functions in the mature nervous system. At first, we investigated the consequence of acute loss of glia on neuronal survival and for that UAS-GAL4 system in combination with GAL80ts, a temperature-sensitive suppressor of GAL4, was used to eliminate glia exclusively in the adult nervous system. Ablation of glia in the mature nervous system of Drosophila induced neuronal cell death and had a dramatic impact on survival and motor performance of the flies. This result underscores the pivotal role of glia in maintaining the normal physiological milieu in the nervous system. This model was further exploited to identify genes contributing glia-specific function in the mature nervous system. Hence, we performed a genome-wide RNAi screen with a sublibrary of human homologs in the adult Drosophila model that we characterized. Each shRNA was specifically expressed in the mature glial cells and lethality or reduced locomotor activity of adult flies were scored. Interestingly, metabolic pathways are predominantly represented in our primary hit list. Next, a systematic bioinformatic analysis followed by secondary assays unveils that glial sphingolipids are critical for axonal ensheathment. Furthermore, we have determined that a specific sphingolipid phosphoethanolamine-ceramide (PE-ceramide) is required for a subtype of glia namely wrapping glia in order to maintain axonal enwrapping to preserve axonal integrity and electrical insulation. The loss of PE-ceramide in wrapping glia is likely to interfere with glial differentiation or axon-glia interaction and therefore, errors in ensheathment processes occurs. Rearrangement of cytoskeleton in glia, that are necessary for insulation process might also be affected upon loss of PE-ceramide. In parallel, we report that the loss of two very long chain fatty acid elongases CG 18609 and baldspot in glia shows reduced viability and they are expressed in the brain. Morphological assay revealed that the loss of baldspot in glia altered glial morphology and subsequent axonal wrapping. baldspot is a homolog of mammalian Elovl6 that synthesizes short monounsaturated and saturated fatty acyl chain. Therefore, it is likely that PEceramide with short fatty acyl chain is critical for axonal ensheathment by glia. Moreover, these sphingolipids may influence the integrity or permeability of different physiological barrier present in the skin or nervous system.
Keywords: Glia; Sphingolipid; RNAi; <i>Drosophila</i>
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Glia spielen eine wichtige Rolle in vielen
Prozessen während der Entwicklung des Nervensystems, sowohl bei
Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen. Eine der entscheidenden
Funktionen von Gliazellen ist die Isolierung von Axonen, und ihnen
Überlebenssignale zu liefern. Diese Isolation ermöglicht eine
schnelle Weiterleitung von Nervenimpulsen. Ziel dieses Projekts war
es, neue Glia-spezifische Funktionen zu identifizierem, die mit
Veränderungen der axonalen Morphologie einhergehen. In dieser
Studie haben wir dafür zunächst ein Drosophila-Modell
charakterisiert, um glia-spezifische Funktionen im reifen
Nervensystem zu studieren. Zuerst untersuchten wir die Folge eines
akuten Verlustes von Glia auf neuronales Überleben. Hierbei wurde
das UAS- GAL4-System in Kombination mit GAL80ts, einen
temperaturempfindlichen Suppressor von GAL4, verwendet, um
Gliazellen ausschließlich im adulten Nervensystem zu eliminieren.
Ablation von Gliazellen im reifen Nervensystems von
Drosophila induzierte neuronalen Zelltod und hatte einen
dramatischen Einfluss auf das Überleben und die Beweglichkeit der
Fliegen. Dieses Ergebnis unterstreicht die zentrale Rolle von
Gliazellen bei der Aufrechterhaltung des normalen, physiologischen
Milieus im Nervensystem. Dieses Modell wurde weiter genutzt, um
Gene zu finden, die zur Glia-spezifischen Funktion im reifen
Nervensystem beitragen. Daher führten wir einen Genom-weiten
RNAi-Screen durch, in dem wir eine Teilbibliothek der menschlichen
Homologen im erwachsenen Drosophila Modell verwendeten. Jede
shRNA wurde speziell in den reifen Gliazellen exprimiert und
Letalität oder reduzierte Bewegungsaktivität von erwachsenen
Fliegen ermittelt. Interessanterweise sind in unserem ersten
Trefferliste überwiegend Stoffwechselwege vertreten. Als nächstes
führten wir eine systematische bioinformatische Analyse und
sekundäre Assays durch und zeigten, dass Sphingolipide in
Gliazellen entscheidend für das Umhüllen der Axone sind. Darüber
hinaus stellten wir fest, dass das Sphingolipid
Phosphoethanolamin-Ceramid (PE-Ceramid) für einen Subtyp von Glia,
die wraping glia, erforderlich ist, um Axone zu umhüllen und so
axonalen Integrität zu bewahren. Der Verlust von PE-Ceramid in
wrapping glia stört vermutlich die gliale Differenzierung oder
Axon-Glia-Interaktion, wodurch Fehler beim Umwickeln auftreten.
Eine Umlagerung des Zytoskeletts in Glia, was notwendig für den
Isolierungsvorgang ist, könnte durch den Verlust von PE-Ceramid
ebenfalls betroffen sein. Zusätzlich zeigten wir, dass der Verlust
von zwei Elongasen für sehr-langkettigen Fettsäuren, CG
18609 und baldspot , in Glia zu verkürzter
Lebensfähigkeit führt, und dass beide Elongasen im Gehirn
exprimiert werden. Morphologische Assays zeigten, dass der Verlust
von baldspot in Glia zu veränderter Morphologie der Zellen
führt und die Umhüllung des Axons beeinträchtigt. Das
Drosophila-Protein baldspot ist ein Homolog des
Säugetierproteins Elovl6, welches kurze, einfach-ungesättigten und
gesättigten Fettsäureketten synthetisiert. Daher ist es
wahrscheinlich, dass PE-Ceramid mit kurzen Fettsäurekette von
entscheidender Bedeutung für axonale Umhüllung durch Glia ist.
Außerdem können diese Sphingolipide Einfluss auf die Integrität
oder Durchlässigkeit der verschiedenen physiologischen Barriere in
der Haut oder dem Nervensystem haben.
Schlagwörter: Gliazellen; Sphingolipide; RNAi; <i>Drosophila</i>